二甲双胍与顺铂联合诱导人结肠癌HCT-8细胞凋亡的研究

于敬坤，李明志，随振阳，张 琪，田 炜，胡 琨,杨光华,张国志,王长友*

(1.华北理工大学附属医院普通外科,河北 唐山 063000; 2.华北理工大学医学实验研究中心,河北 唐山 063000)

结肠癌是最常见的胃肠道恶性肿瘤之一，在我国，其发病率及死亡率均高于世界水平，无数患者饱受结肠癌病痛的折磨[1]。目前，我国治疗结肠癌的主要方式包括外科手术切除及以其为基础的综合治疗、化学药物治疗、放射治疗、新辅助放化疗等；但我国结直肠癌患者术后5年生存期依然徘徊在60%左右。二甲双胍(metformin)是临床上常用的降糖药物，但有相关病例对照研究资料表明，二甲双胍的使用与恶性肿瘤发生风险的下降具有一定相关性，二甲双胍使用时间的延长及使用次数的增加，可使恶性肿瘤的发病风险降低[2-3]。凋亡是细胞生长增殖过程中重要的调节方式，在肿瘤细胞的发生、发展及死亡过程中发挥着重要作用。该实验研究二甲双胍联合顺铂对HCT-8人类结肠癌细胞的影响，并探究其机制，为二甲双胍优化化疗方案提供实验依据及理论基础。

1 材料和方法

1.1 实验材料

HCT-8人类结肠癌细胞获赠于华北理工大学医学实验研究中心分子诊断实验室。

1.2 主要试剂与仪器

DMEM完全培养基(赛默飞世尔[苏州]仪器有限公司)；四季青胎牛血清(浙江天杭生物公司)；青链霉素混合液、胰蛋白酶(美国Gibco)；盐酸二甲双胍(北京索莱宝科技有限公司)；顺铂注射液(江苏豪森药业股份有限公司)；MTT试剂盒、caspase-3(激活型)抗体、HRP标记山羊抗小鼠/兔IgG(H+L)(上海碧云天生物技术研究所)；96孔板、6孔板(德国Eppendorfna)；显微镜(日本Nikon Eclipse TS100)；酶标仪、显影仪、电泳转膜相关器材(上海Bio-Rad公司)；Bcl-2、Bax、Akt、p-Akt、Gsk-3、p-Gsk-3 抗体(Cell Signaling)；GAPDH抗体(天徳悦[北京]生物科技有限责任公司)；流式细胞仪及FITC偶联Annexin V凋亡检测试剂盒I(美国BD公司)等。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养

用含10%胎牛血清、1%青链霉素混合液、约90% DMEM完全培养基的细胞培养液培养HCT-8人类结肠癌细胞，并置于37℃恒温、95%O2、5%CO2空气孵箱中(相对湿度为95%)。细胞生长密度达80%以上时，可1∶2或1∶3传代(传代时间约为2～3 d)，HCT-8细胞呈单层贴壁生长，待形成致密单层细胞时，可利用胰酶消化，取状态良好的对数生长期细胞进行实验。

1.3.2 MTT实验检测细胞增殖能力

将HCT-8人类结肠癌细胞均匀地播种在96孔板中(每孔约104个细胞)，待细胞完全贴壁后，分别用含有不同浓度盐酸二甲双胍(0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 mg/mL)、不同浓度顺铂(0、5、10、15、20、25、30、35、40、45 μg/mL)的细胞培养液培养；培养 24、48、72 h后移除细胞培养液，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗两次。每孔加入了100 μL的的单纯细胞培养液及10 μL浓度为5 mg/mL的MTT试剂；将96孔板置于恒温箱内孵化，待紫蓝色结晶完全形成后移除细胞培养液，然后加入100 μL的二甲基亚砜溶液(DMSO)，轻轻晃动使结晶完全溶解，并用酶标仪测定各孔在490 nm波长下的吸光值。注意设置空白对照组。

根据MTT剂量依赖性实验结果，1.50 mg/mL盐酸二甲双胍、20 μg/mL顺铂对HCT-8细胞具有抑制作用，且在有效抑制范围内，便于调控，因此可采用1.50 mg/mL盐酸二甲双胍、20 μg/mL顺铂作为后续实验的药物浓度，设置二甲双胍组(MET)、顺铂组(DDP)、二甲双胍联合顺铂组(MET+DDP)、空白对照组(CK)4组，继续行MTT实验，观察HCT-8细胞24、48、72 h的增殖能力，并判断两种药物的协同作用。

药物协同作用效能用协同指数(combined index,CI)来表示，采用金正均法(概率相加法)计算：

EA+B=EA+EB-EA×EB

其中EA代表A药单独作用时的效应；EB是B药单独作用时的效应；EA+B是A药与B药联合作用时的效应，为联合用药效应的期望值。

虚拟仿真实验技术是指以计算机网络为核心，利用多媒体技术虚拟实验环境进行人机交互和仿真，学生利用虚拟实验教学平台，可在模拟的真实环境中完成实验项目，该实验技术已经在医药院校逐步应用[4-5]。2013年8月教育部发布教高司函〔2013〕94号文件，在全国开展“国家级虚拟仿真实验教学中心”的认定工作，文件提出将现代信息技术整合至教学应用中，从国家层面确认了对网络化虚拟学习的认可[6]。虚拟实验教学已经迅速发展成为现代实验教学的重要方式之一，这种教学模式可以培养学生的实践能力和创新能力，提高应用型人才培养的质量。

Q=EA+B÷(EA+EB-EA×EB)

Q值的意义：0.85-1.15为效应单纯相加；1.15-20为效应增强；>20为效应显著增强；0.85-0.55为效应拮抗；<0.55为相应明显拮抗(协同作用：两种以上药物联合应用时，如各药物的作用方向一致为协同作用；反之成为拮抗作用；当Q值≥0.85时，即两种药物具有协同作用)。

1.3.3 流式细胞术检测细胞凋亡比例

将HCT-8人类结肠癌细胞均匀地播种在6孔板中并培养，密度达70%～80%时分别给予含1.5 mg/mL盐酸二甲双胍(MET组)、20 μg/mL顺铂(DDP组)、1.5 mg/mL盐酸二甲双胍及20 μg/mL顺铂(MET+DDP组)、不含药物(CK组)的细胞培养液2 mL继续培养， 48 h后移除细胞培养液，各组均收集约106个细胞于5 mL试管内；试管内加入400 μL的1X Binding Buffer及5 μL FITC Annexin V，室温孵化15 min后加入5 μL PI，在流式细胞仪中检测各组细胞的凋亡比例，并计算联合用药的协同指数。

1.3.4 Western blotting观察HCT-8人类结肠癌细胞Bcl-2、Bax、caspase-3(激活型)以及AKT/GSK-3 通路蛋白的表达水平

将HCT-8人类结肠癌细胞同上分组并培养，48 h后用预冷的PBS洗涤细胞3次，每孔内加入100 μL含有1%PMSF的组织细胞裂解液，冰上裂解30 min后刮下细胞并在预冷的低温高速离心机中离心15 min(14000 r/min)，收集上清液。BCA法测定蛋白浓度并变性，依次制备8%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，湿转转膜将蛋白转到硝酸纤维素膜(PVDF膜)上，室温下封闭液(5% 脱脂奶粉、0.02 mmol/L Tris-HCL、0.5 mmol/L NaCl、0.1% 吐温20、pH 7.5)封闭2 h，TBST(0.02 mmol/L Tris-HCL、0.5 mmol/L NaCl、0.1% 吐温20、pH 7.5)洗膜3次后，4℃敷一抗过夜，TBST洗膜3次后加入二抗孵化2 h，TBST洗净二抗，加入显影剂在显影仪内显影，以GAPDH为内参蛋白，在内参平齐的前提下，观察各组细胞中各蛋白的表达。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 MTT检测细胞增殖能力

2.1.1 盐酸二甲双胍及顺铂对HCT-8人类结肠癌细胞增殖能力、相对增殖能力的影响

在不同浓度盐酸二甲双胍作用下，24 h时HCT-8人类结肠癌细胞在盐酸二甲双胍浓度下约0～2.00 mg/mL范围内，出现细胞增殖强于无药物干预(可能由于药物诱发细胞应激性增殖)，药物浓度高于2 mg/mL时，HCT-8细胞增殖能力随药物浓度升高而逐渐递减；48、72 h时，在盐酸二甲双胍浓度为0～4.50 mg/mL范围内，HCT-8细胞的增殖能力总体上与药物浓度呈负相关关系，随着盐酸二甲双胍药物浓度的增高，细胞增殖能力随之递减(图1)。在不同浓度顺铂作用下，24 h时HCT-8细胞的增殖能力与顺铂药物浓度呈负相关；48、72 h时HCT-8细胞增殖能力均在一定浓度范围内随顺铂浓度增高而降低，48 h顺铂浓度约高于30 μg/mL、72 h顺铂浓度约高于15 μg/mL时，HCT-8细胞增殖能力不随顺铂浓度增高而发生明显改变(图2)。在盐酸二甲双胍及顺铂作用下，HCT-8细胞的相对增殖能力随着作用时间的延长(相对增殖能力=某一时间内实验组的细胞增殖能力/同时刻对照组的细胞增殖能力×100%；相对增殖能力可反映细胞增殖受抑制程度)，总体上表现为递减趋势(图1、图2)。

图1 盐酸二甲双胍对HCT-8人类结肠癌细胞增殖能力及相对增殖能力的影响Figure 1 The effect of metformin hydrochloride on proliferation and relative proliferation ability of human colon cancer HCT-8 cells

图2 顺铂对HCT-8人类结肠癌细胞增殖能力及相对增殖能力的影响Figure 2 The effect of cisplatin on proliferation and relative proliferation ability of human colon cancer HCT-8 cells

MTT检测HCT-8人类结肠癌细胞在1.50 mg/mL盐酸二甲双胍、20 μg/mL顺铂及联合作用24、48、72 h时的细胞增殖能力；如表1，盐酸二甲双胍组(MET)、顺铂组(DDP)及联合用药组(MET+DDP)的细胞增殖能力要弱于空白对照组(CK)，联合用药组(MET+DDP)的细胞增殖能力明显低于其它3组(P<0.05)。药物协同指数(CI)Q值在药物作用24、48、72 h时均大于0.85，提示MET+DDP的联合抗HCT-8细胞增殖能力的作用强于MET组、 DDP组。

1.5 mg/mL盐酸二甲双胍、20 μg/mL顺铂及联合用药作用于HCT-8人类结肠癌细胞48 h时(图3)，对照组的HCT-8细胞体积较小，排布密集，形态较为规整，可见分裂核；顺铂组较对照组细胞体积增大明显，多核细胞比例增多；二甲双胍组较对照组，细胞体积增大，胞质空泡化明显；联合用药组细胞既体积增大明显，胞质又出现空泡化。

2.2 1.5 mg/mL盐酸二甲双胍、20 μg/mL顺铂及联合用药对HCT-8人类结肠癌细胞凋亡的影响

DDP组、MET组、MET+DDP组、CK组四组的总凋亡比例分别是(19.7267±0.2043)%、(16.2567±1.3258)%、(33.7567±0.7182)%、(10.3667±0.1301)%；本实验中，当1.5 mg/mL盐酸二甲双胍、20 μg/mL顺铂及联合用药作用于HCT-8人类结肠癌细胞48 h时(图4)，均可引起HCT-8细胞的总凋亡比例上升(对比CK组，并具有统计学差异，P<0.05)；MET+DDP组HCT-8细胞的总凋亡比例最高，且均强于MET组、DDP组及CK组，P<0.05。MRT+DDP组促HCT-8细胞凋亡的协同指数为1.0299>0.85，提示1.5 mg/mL盐酸二甲双胍与20 μg/mL顺铂对促进HCT-8细胞具有协同作用。

2.3 Western blotting 检测药物作用48 h时相关蛋白的表达活性

2.3.1 1.5 mg/mL盐酸二甲双胍、20μg/mL顺铂及联合用药影响HCT-8人类结肠癌细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达

Bcl-2的活性在CK、MET、DDP、MET+DDP 4组内依次为(1.0383±0.1496)、(0.8422±0.1228)、(0.6507±0.1493)、(0.4629±0.1315)，4组间彼此存在统计学差异，且呈递减趋势，P<0.05；而Bax的活性在CK、MET、DDP、MET+DDP 4组内依次为(0.5714±0.1226)、(0.7379±0.1108)、(0.9001±0.1008)、(1.1355±0.1302)，4组间也彼此存在统计学差异，且呈递增趋势，P<0.05；Bax/Bcl-2值在CK、MET、DDP、MET+DDP 4组内分别是(0.6398±0.1988)、(0.8887±0.1505)、(1.2557±0.1943)、(1.9982±0.3168)，依次递增，并具有统计学意义，P<0.05(图5)。

2.3.2 1.5 mg/mL盐酸二甲双胍、20μg/mL顺铂及联合用药影响HCT-8人类结肠癌细胞凋亡相关蛋白caspase-3(激活型)的表达药物作用48 h时，caspase-3(激活型)的表达在CK、MET、DDP、MET+DDP 4组内分别是(0.5701±0.0535)、(0.7288±0.0855)、(0.8302±0.0506)、(0.9347±0.0902)，且caspase-3(激活型)的表达呈依次递增的趋势，并具有统计学意义，P<0.05(图6)，提示在MET+DDP组HCT-8细胞中无凋亡促进活性的p-caspase-3进行蛋白剪切形成具有促凋亡活性的caspase-3(激活型)的比例增高。

表1 盐酸二甲双胍联合顺铂对HCT-8人类结肠癌细胞增殖能力的影响(OD值)Table 1 The effect of metformin hydrochloride combined with cisplatin on the proliferation capacity of human colon cancer HCT-8 cells (OD value)

注：与DDP组相比，*P<0.05；与MET组相比，#P<0.05；与MET+DDP组相比，※P<0.05；与CK组相比，&P<0.05。

Note: Compared with the DDP group,*P< 0.05.Compared with the MET group,#P< 0.05.Compared with the MET+DDP group,※P< 0.05. Compared with the CK group,&P< 0.05.

注：DDP、MET、MET+DDP、CK四组给予相应处理48 h后各组细胞的形态学改变。图3 DDP、MET、MET+DDP、CK 各组HCT-8细胞于培养48 h的细胞观察(×200)Note. The morphological changes of HCT-8 cell in the DDP, MET, MET+DDP and CK groups were given corresponding treatment for 48 h.Figure 3 Observation of the HCT-8 cells in DDP, MET, MET+DDP and CK groups after 48 h

注：DDP、MET、MET+DDP、CK四组相比较，*P<0.05。图4 盐酸二甲双胍联合顺铂作用于HCT-8人类结肠癌细胞48 h时对其凋亡的影响Note. Compared with the four groups of DDP, MET, MET+DDP and CK, *P< 0.05.Figure 4 Effect of metformin hydrochloride combined with cisplatin on apoptosis in the HCT-8 human colon cancer cells at 48 h after treatment.

2.3.3 1.5 mg/mL盐酸二甲双胍、20 μg/mL顺铂及联合用药影响HCT-8人类结肠癌细胞AKT/GSK-3β通路蛋白的表达

AKT/GSK-3β通路蛋白在CK、MET、DDP、MET+DDP 各组内的活性如图7所示，AKT、GSK-3β在4组内表达活性无明显差异，P>0.05；p-AKT、p-GSK-3β在CK、MET、DDP、MET+DDP 4组内分别表达为(1.0928±0.1182)、(0.8350±0.0579)、(0.7247±0.0500)、(0.6021±0.0447)及(1.0167±0.0669)、(0.8467±0.1017)、(0.6899±0.0680)、(0.5551±0.0710)，且均表现为依次递减趋势，并具有统计学意义(P<0.05)。

注： DDP、MET、MET+DDP及CK四组相比较，* P<0.05，# P<0.05，&P<0.05。图5 DDP、MET、MET+DDP、CK各组HCT-8人类结肠癌细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达活性Note. Compared with the four groups of DDP, MET, MET+DDP and CK, * P < 0.05,# P<0.05,& P<0.05.Figure 5 Expression of Bcl-2 and Bax of HCT-8 human colon cancer cells in the DDP, MET, MET+DDP and CK groups

注： DDP、MET、MET+DDP及CK四组相比较，* P<0.05。图6 DDP、MET、MET+DDP、CK各组HCT-8人类结肠癌细胞凋亡相关蛋白caspase-3(激活型)的表达活性Note. Compared with the four groups of DDP, MET, MET+DDP and CK, *P < 0.05.Figure 6 Expression of caspase-3 (activated) in the human colon cancer HCT- 8 cells of the DDP, MET, MET+DDP and CK groups

注： DDP、MET、MET+DDP及CK四组相比较，*P<0.05，# P<0.05。图7 DDP、MET、MET+DDP、CK各组HCT-8人类结肠癌细胞AKT/GSK-3β通路蛋白的表达活性Note. Compared with the four groups of DDP, MET, MET+DDP and CK, * P<0.05,# P<0.05.Figure 7 Protein expression of AKT/GSK-3β signaling pathways in the human colon cancer HCT-8 cells in the DDP, MET, MET+DDP and CK groups

3 讨论

结肠癌是我国第6大高发恶性肿瘤，在癌症死亡患者中排第5位[4]；主要是由长期不合理饮食、肠道慢性病恶变、遗传等因素引起，近年来逐渐趋于青少年发展[5-6]，相关研究指出肥胖患者及糖尿病患者结肠癌的发病风险会高于正常人[7-9]。铂类药物(platinum drugs)是治疗结肠癌的重要化疗药物，具有较高的抗肿瘤效能，诸多基础实验及临床研究已证明单用或联合应用铂类药物均有明显的抗肿瘤作用[10-13]。顺铂(cisplatin、DDP)是第一代铂类药物，属于细胞周期非特异性药物，可通过抑制细胞核分裂使癌细胞生长周期受抑制[14]，但胞质受影响较小，因此可出现胞体增大现象。实验中顺铂可明显降低HCT-8人类结肠癌细胞的增殖能力，并存在剂量及时间依赖性。但顺铂也有明显的不良反应，如恶心、呕吐等消化道反应及肾毒性、神经毒性、骨髓抑制、过敏反应、心肺功能异常等，减少顺铂用药可减少不良反应的发生或减轻不良反应的程度[15]；另外，随着顺铂等铂类药物的使用，肿瘤细胞耐药性也会逐渐增强[16]。因此联合用药、减少顺铂的使用成为现代医学研究的重点之一。二甲双胍是临床上的一线降糖药物。随着对其研究的不断深入，部分学者提出二甲双胍具有降低肿瘤发生风险的作用[17-19]；有实验表明二甲双胍可能通过促进胞内脂类物质代谢、调节机体内分泌水平、抑制血小板亢进及降低血液高凝状态等途径，抑制肿瘤细胞的发生、发展[20]；在一定药物范围内，随着盐酸二甲双胍浓度的增高及作用时间的增加，HCT-8人类结肠癌细胞的增殖能力也随之降低，表明二甲双胍可抑制HCT-8细胞的生长、增殖，并存在剂量、时间依赖性(图1)。且二甲双胍与顺铂具有一定的协同效果，二者联合用药时，HCT-8细胞的增殖能力均明显弱于单药使用，提示二甲双胍可减少化疗药物的使用剂量，优化化疗方案。

凋亡是细胞生长增殖过程中重要的调节方式，可主动清除衰老、破损、具有异常功能及潜在危险的细胞，如有癌变危险且自身又无法修复逆转的细胞等[21]。胞质空泡化是细胞凋亡的重要表现形式，二甲双胍可使HCT-8人类结肠癌细胞出现胞质空泡化，可见二甲双胍具有促进HCT-8细胞凋亡的潜能[22]。流式细胞术检测结果(图4)提示，1.50 mg/mL盐酸二甲双胍、20 μg/mL顺铂及联合用药可增强HCT-8细胞的凋亡，并且联合用药引起HCT-8细胞的凋亡比例明显高于单药使用。细胞凋亡的调控信号通路主要分为外在信号通路(细胞表面死亡受体途径)及内在信号通路(线粒体凋亡通路)[22-23]。Bcl-2家族蛋白是调控细胞凋亡的关键因子，主要调控内在凋亡途径，作用靶点是线粒体[24]。Bcl-2是Bcl-2家族中典型的抗凋亡蛋白，而Bax是促凋亡蛋白，二者协同发挥作用，通过改变线粒体外膜的通透性、改变线粒体形态、影响膜间隙蛋白释放及caspase级联活化等途径影响细胞凋亡过程[25]。HCT-8细胞在二甲双胍、顺铂作用下，促凋亡蛋白Bax活性明显增高，抑凋亡蛋白Bcl-2活性降低，Bax/Bcl-2值明显增高，表明二甲双胍及顺铂均可通过调控线粒体凋亡途径促进HCT-8细胞的凋亡，且二者联合作用时，Bax/Bcl-2值较单药作用结果均明显增高，说明联合用药可能调控线粒体凋亡途径作用更强。

天冬氨酸特异性蛋白酶(caspases)是另一组与细胞凋亡密切相关的蛋白酶家族，在细胞凋亡最终途径的调控中具有关键作用[26]。caspase-3(激活型)是重要的凋亡效应因子，是凋亡的执行蛋白、凋亡关键的蛋白酶[27]；正常细胞中的caspase-3是以无活性的p-caspase-3存在的，在一定条件下，p-caspase-3可通过蛋白剪切形成具有活性的caspase-3(激活型)，从而诱发级联放大效应，促进细胞凋亡。在MET、DDP、MET+DDP组中，HCT-8人类结肠癌细胞的caspase-3(激活型)活性均高于CK组，且MET+DDP组的caspase-3(激活型)活性也高于其他各组，再次说明二甲双胍与顺铂具有协同促HCT-8细胞凋亡作用。 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT)是细胞内重要的通路蛋白，可广泛参与细胞的生理病理过程，其活性表达形式p-AKT(磷酸化AKT)可以通过促进丝氨酸/苏氨酸残基底物磷酸化从而发挥促进细胞增殖、抑制凋亡作用[28-29]；糖原合成激酶-3β(GSK-3β)是AKT的直接作用底物之一，p-AKT可以与GSK-3β直接结合，改变其Ser9位点结构，使GSK-3β发生磷酸化修饰，从而抑制GSK-3β活性[30]。盐酸二甲双胍、顺铂分别作用于HCT-8人类结肠癌细胞后，肿瘤细胞内AKT、GSK-3β活性相对恒定不变，p-AKT、p-GSK-3β活性明显降低，说明二甲双胍及顺铂均可能通过抑制AKT/GSK-3β信号通路实现促凋亡作用；当盐酸二甲双胍联合顺铂作用于HCT-8细胞时，p-AKT、p-GSK-3β的活性较单药作用减弱，表明联合用药可协同加强对AKT/GSK-3β信号通路的抑制作用。

综上，二甲双胍、顺铂可能通过调控AKT/GSK-3β/Bcl-2家族蛋白通路促进HCT-8人类结肠癌细胞的凋亡，并促进p-caspase-3转化为caspase-3(激活型)；二甲双胍与顺铂对HCT-8细胞凋亡具有协同作用，联合用药促凋亡作用强于单药作用。