MEG3在肿瘤中作用的研究进展

李宝华，葛瑞胜，郭林顿，毕丹丹，陈晓宇，成 浩，张淑君※

(1.哈尔滨医科大学附属第四医院病理科，哈尔滨 150001； 2.哈尔滨医科大学， 哈尔滨 150001)

长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是一类不具有蛋白编码功能的RNA，其编码产物长度>200个核苷酸[1]。人母系表达基因3(maternally expressed gene 3，MEG3)，属于双亮氨酸拉链激酶1-MEG3印记区，位于人类染色体14q32.2[2]，其编码产物是一条长约1.6 kb的lncRNA。

研究发现，MEG3表达于人的很多正常组织中，而检测多种人类癌症组织及细胞株发现MEG3表达下调，并且其低表达水平与肿瘤的发生、发展相关，而在各种肿瘤细胞系中异位表达MEG3可以表现出其具有抑制肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭或促进肿瘤细胞凋亡的作用，因此MEG3被认为是一种潜在的肿瘤抑制因子[3-4]。MEG3的肿瘤抑制作用已经在多项研究中取得进展，研究发现MEG3的表达缺失或许与其基因启动子的高甲基化状态有关，降低基因启动子甲基化水平可能恢复MEG3的表达[5-6]。MEG3可能通过转录水平和表观遗传水平等调控靶基因或某些功能性RNA的表达，或直接结合某些蛋白并促进其降解，参与对p53途径[7]、Rb途径[8]、人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN)/磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinosi-tide 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)途径等的调节，从而参与肿瘤抑制作用[9]。然而，MEG3在肿瘤中的具体作用尚未完善，现就MEG3在各种肿瘤中的作用及其部分机制予以综述。

1 MEG3结构和功能

lncRNA是RNA聚合酶Ⅱ转录的副产物，起初被认为是基因组转录的“垃圾序列”[10]，不具有生物学功能。然而在后续的研究中发现，lncRNA可以在转录、转录前和表观遗传等水平上调控基因的表达，参与各种生物学进程。其中INK4基因座反义非编码RNA(antisense non-coding RNA in the INK4 locus，ANRIL)[11]、HOX反义基因间RNA(HOX antisense intergenic RNA，HOTAIR)[12]、牛磺酸上调基因1(taurine up-regulated gene 1，TUG1)[13]等在肿瘤中呈高表达，并表现出促进肿瘤发生、发展进程的作用。而生长停滞特异性转录本5(growth arrest-specific transcript 5，GAS5)[14]、MEG3等在肿瘤中的表达被弱化，对其过表达可观察到抑制肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭或促进凋亡的抗肿瘤作用。基因组结构分析发现，MEG3由10个外显子组成，可通过选择性剪接产生12种不同的基因亚型[15]。通过创建MEG3剪切体并进行功能及结构分析，发现RNA的折叠对MEG3激活p53的功能至关重要[16]。研究表明，MEG3具有很多抑癌基因的特性，与正常组织细胞相比MEG3在肺癌[17]、食管癌[18]、胃癌[19]、结直肠癌[20]、肝癌[21]、乳腺癌[22]、宫颈癌[23]、非功能性垂体腺瘤[24]等肿瘤组织中的表达均下调，并且MEG3低表达与肿瘤的发生和发展密切相关。多种机制与MEG3表达的丧失有关，包括基因缺失、启动子高甲基化和基因间差异甲基化区域的超甲基化。随着对MEG3的深入研究发现，MEG3发挥抗肿瘤作用与影响调节Rb途径、p53途径、PTEN/PI3K/Akt途径，及通过与微RNA的相互作用靶向某些抑癌基因等相关[9]。随着对MEG3研究的深入，其有望成为肿瘤诊断、治疗、判断预后的新靶点。

2 MEG3与肿瘤的关系

2.1MEG3与肺癌 视网膜母细胞瘤基因(retinoblastoma gene，Rb)通路在许多人类癌症中被破坏。Rb通过与E2F转录因子家族结合并抑制其活性来调节细胞周期进程和增殖。Rb失活与细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)，特别是CDK4和CDK6的磷酸化有关。但其他机制也起到调节细胞周期进程和细胞增殖的作用，包括某些微RNA和lncRNA的下游效应子。Kruer等[8]通过用palbociclib(一种CDK4/6抑制剂)处理肺癌细胞系A549和人肺鳞癌细胞(human lung squamous carcinoma cell line，SK-MES-1)激活pRb，发现MEG3可能是Rb途径的下游靶标。palbociclib同时也降低了DNA甲基转移酶1(DNA methyl-transferase 1，DNMT1)的表达， DNMT1的沉默导致两种细胞类型中MEG3基因座的甲基化降低、MEG3的表达增加，表明DNMT1有助于MEG3的沉默。MEG3重新表达后，G1期细胞周期停滞，细胞凋亡增加。palbociclib或其他CDK4/6抑制剂或许可用于靶向治疗，依赖于MEG3调节生长途径的多种肿瘤类型。

Yan-Hua等[17]检测40对癌及癌旁组织，再次证明MEG3在肺癌组织中表达下调。异位表达MEG3发现其具有抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡的功能，并能抑制肿瘤细胞的迁移，发现MEG3可以负调控myc基因的表达，并且该调节可能补充MEG3在肺癌细胞中的肿瘤抑制作用。

综上所述，肺癌中MEG3的表达水平降低，并可能与基因启动子的甲基化水平呈负相关，通过激活Rb途径可能恢复MEG3的表达。MEG3的过表达可以调控某些靶基因的表达，如负调控MYC的表达，并且抑制细胞增殖、诱使细胞周期停滞、诱导细胞凋亡，从而表现出抗肿瘤的生物学行为。

2.2MEG3与消化系统肿瘤 Dong 等[18]对143例食管鳞状细胞癌患者的临床标本研究分析发现，MEG3的甲基化状态与TNM分期、浸润深度、淋巴结转移和远处转移或复发有关，MEG3的高甲基化可能是沉默其表达的机制之一。MEG3可通过竞争性结合miR-9而充当内源竞争性 RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)以调节上皮钙黏蛋白和叉头框蛋白O1(forkhead box O1，FOXO1)的表达，可能是MEG3一种新的抗肿瘤作用机制。Xu 等[19]发现，在胃癌组织及细胞系中MEG3表达下调，而miR-21的表达上调。过表达MEG3显著抑制细胞的侵袭和迁移能力，且迁移和侵袭相关的基质金属蛋白酶(matrix metalloprotainase，MMP)家族中的MMP-3、MMP-9和血管内皮生长因子的表达水平降低。MEG3可能通过负调控miR-21的表达抑制上皮-间充质转化，从而抑制胃癌细胞的侵袭和迁移。

Peng等[25]通过使用实时定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)分析50对临床胃癌样品，发现较低的MEG3水平与胃癌的临床分期相关。MEG3可能作为ceRNA竞争性结合miR-181家族，上调B细胞淋巴瘤2(B-cell leukemia 2，Bcl-2)，抑制胃癌细胞增殖、迁移和侵袭以及促进胃癌中的细胞凋亡而充当肿瘤抑制剂。Yan等[6]检测52对胃癌组织及邻近正常组织发现MEG3低表达与基因甲基化相关，miR-148a可以负向调控参与甲基化修饰的主要酶之一DNMT1的表达，从而激活MEG3的表达，抑制肿瘤细胞增殖。

近年发现的一种凋亡蛋白，聚集素Clusterin经常在多种类型的癌症中过表达，包括前列腺癌、乳腺癌、肺癌和结直肠癌[26]。据报道，Clusterin通过激活核因子κB和Bcl-2信号通路，抑制肿瘤坏死因子-α诱导的乳腺癌细胞凋亡[27]。它还通过激活肝细胞癌中的真核翻译起始因子3I(eukaryotic translation initiation factor 3I,EIF3I)/Akt/MMP-13信号转导通路来刺激细胞的迁移和转移[28]。Zhu等[20]发现，MEG3在结直肠癌中明显下调。原位杂交技术评估371个结直肠癌患者样品的MEG3表达，发现MEG3低表达是结直肠癌患者总生存率差的独立预后因素。通过基因差异表达细胞系的建立和动物模型实验，发现MEG3在体外和体内抑制结直肠癌细胞迁移和转移，并可能是通过下调Clusterin表达水平及其与Clusterin蛋白的直接结合引起的。

肌肉丙酮酸激酶同工酶2(pyruvate kinase isozyme type M2，PKM2)催化糖酵解的最后一步，在癌细胞的生长、存活和代谢重编程中起关键作用。Zheng等[21]发现,MEG3促进miR-122的表达和成熟，而miR-122靶向PKM2 信使RNA(messenger RNA，mRNA)的3′非翻译区抑制PKM2的表达，MEG3通过PKM2减少和肝癌细胞中PTEN的增加来抑制β联蛋白活性，而起到肿瘤抑制剂的作用，可能为肝癌的治疗提供潜在的治疗靶点。

Zhu 等[4]在肝癌中发现，MEG3增强p53的稳定性和转录活性，并且对p53转录活性的激活依赖于其结构的完整性。MEG3还能与p53的中心序列特异性DNA结合结构域结合，使p53的靶基因上调。并提出一种新的假设，MEG3和p53结合形成化合物被募集到特定靶基因，然后MEG3解离，并且p53开始激活靶基因，发挥肿瘤抑制作用。

在消化系统肿瘤中MEG3的表达水平下调，并可能与基因甲基化相关。 MEG3可能直接靶向某些基因调控其表达，也可能作为内源竞争性RNA与某些microRNA结合，从而调节靶基因的表达。在消化系统肿瘤中MEG3的过表达通过抑制细胞的增殖、侵袭和迁移能力，以及抑制上皮-间充质转化，表现出肿瘤抑制的能力。

2.3MEG3与女性生殖系统肿瘤 Zhang等[22]发现，MEG3在乳腺癌组织中的表达明显下调，并且MEG3水平与分化程度、TNM分期和淋巴结转移显著相关。Kaplan-Meier分析发现MEG3表达低的患者的总生存率和无进展生存期差，而多变量Cox分析显示，MEG3低表达可以作为乳腺癌患者5年总生存率和5年无进展生存期的独立不良预后因素。 Xiu 等[29]研究发现，MEG3的表达与上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer，EOC)的肿瘤发生和进展相关，MEG3 mRNA在EOC组织中低表达。MEG3表达的上调显著抑制EOC细胞增殖，并可导致G2期阻滞和早期细胞凋亡增加，诱导细胞自噬。免疫组织化学分析显示，MEG3过表达后自噬相关基因3和微管相关蛋白轻链3表达显著升高，核糖核蛋白免疫共沉淀测定证实了MEG3和自噬相关基因3之间的功能性相互作用。从而表明MEG3的表达上调可能通过与自噬相关基因3的相互作用触发自噬，从而抑制EOC的肿瘤发生和进展。 MEG3可能作为EOC的潜在生物学标志物。Zhang等[23]发现，宫颈癌组织中MEG3的表达显著降低。Kaplan-Meier分析显示，MEG3低表达组患者的无复发和总生存期明显短于MEG3高表达组。多变量分析证实，MEG3是无复发存活的独立预后标志物。甲基化特异性PCR评估MEG3启动子的甲基化状态发现宫颈癌与启动子高甲基化之间存在正相关，MEG3重新表达可以抑制宫颈癌细胞的增殖，MEG3甲基化是宫颈癌的危险因素。MEG3甲基化是高危型人乳头瘤病毒感染和淋巴结转移的危险因素。Zhang 等[30]发现MEG3在宫颈癌组织中下调，MEG3低表达水平与肿瘤大小、淋巴结转移、高危型人乳头瘤病毒感染和国际妇产科协会分期呈正相关，表明MEG3的下调可能与宫颈癌的发展有关。MEG3的过表达抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，p53和胱天蛋白酶(caspase) 3的表达显著增加。同时Pearson相关分析表明，miR-21-5p的表达与宫颈癌组织中的MEG3水平呈负相关，过往研究观察到miR-21是宫颈癌中的一种oncomiR，基因转染和敲除实验结果证明miR-21-5p与MEG3呈负相关，并且 miR-21-5p可以挽救MEG3对细胞增殖和凋亡的影响，miR-21-5p抑制至少部分地促成由MEG3诱导的p53积累。

以上所述，在女性生殖系统肿瘤中，MEG3的表达水平较正常组织降低，且与甲基化水平相关，过表达MEG3表现对肿瘤细胞抑制增殖，诱导凋亡及自噬的作用。统计分析发现MEG3低表达可能作为乳腺癌不良预后因素，可能成为EOC的潜在标志物，MEG3甲基化可能是宫颈癌人乳头瘤病毒感染和淋巴结转移的危险因素。

2.4MEG3与神经内分泌系统肿瘤 甲基化在非功能性垂体腺瘤(nonfunctional pituitary adenoma，NFA)中沉默MEG3基因中起作用，而组蛋白脱乙酰化也是使NFA中的MEG3失活的表观遗传机制之一。Chunharojrith等[24]发现MEG3能够明显抑制肿瘤细胞生长，诱导肿瘤细胞G1期停滞，MEG3对肿瘤的抑制需要功能性p53，p53的失活完全消除了MEG3对肿瘤的抑制，表明在NFA中MEG3可能通过p53通路发挥抑癌作用。

Li等[7]发现在胶质瘤中，DNMT1的敲减能抑制神经胶质瘤细胞的生长，并诱导胶质瘤细胞的凋亡，逆转MEG3启动子的甲基化，随后恢复MEG3的表达。DNMT1介导的MEG3启动子甲基化沉默可能激活鼠双微体2的表达。鼠双微体2可以结合p53基因的启动子，抑制其转录，也可以通过泛素化作用降解p53蛋白，从而导致p53途径的失活，参与肿瘤形成。MEG3的表达可以通过表观遗传修饰来恢复，这可能表明其具有神经胶质瘤的治疗潜力。

胰腺神经内分泌肿瘤是由胰岛细胞引起的罕见肿瘤。Zhang等[31]发现，异位表达MEG3后细胞周期相关蛋白(包括增殖细胞核抗原、周期蛋白 E1、周期蛋D1、CDK1和CDK4)均下调，包括Bax、caspase-3和caspase-9在内的促凋亡蛋白则显著上调，而抗凋亡蛋白Bcl-2被下调，且MEG3显著减少细胞的迁移和侵袭。实验发现，miR-183是MEG3的直接靶标。此外，人神经系统特异表达基因脑蛋白I3(brain protein I3，BRI3)受miR-183的正调控，BRI3可能通过激活BON1细胞中p38/胞外信号调节激酶/Akt和Wnt/β联蛋白信号通路而发挥肿瘤促进作用。故而推测MEG3/miR-183/BRI3轴可能是胰腺神经内分泌肿瘤的关键因素。

Gao等[32]发现，MEG3启动子的高甲基化与视网膜母细胞瘤显著相关。经过DNA去甲基化试剂地西他滨(5-Aza-2′eoxycytidine，5-Aza-CdR)处理的细胞，MEG3表达显著升高，并能显著降低细胞增殖、增加早期凋亡细胞的数量。而敲除MEG3能够逆转5-Aza-CdR对MEG3重新表达的影响。这些结果表明，5-Aza-CdR在视网膜母细胞瘤中的肿瘤抑制作用部分归因于MEG3重新表达，其可能存在的途径如下：5-Aza-CdR→MEG3的启动子去甲基化→MEG3的上调→Wnt/β联蛋白途径的失活→视网膜母细胞瘤细胞的生长抑制，为视网膜母细胞瘤中MEG3的机制提供了新的视角，并提示MEG3甲基化状态的评估可能是确定视网膜母细胞瘤患者预后有用的生物学标志物。

总结以上内容发现，NFA中MEG3失活不仅仅由于甲基化，组蛋白脱乙酰化也是调节MEG3表达的表观遗传机制之一，MEG3的异位表达可下调细胞周期相关蛋白并上调凋亡相关蛋白，抑制肿瘤细胞迁移和侵袭。去甲基化药物地西他滨能恢复MEG3的表达并抑制细胞增殖、诱导早期凋亡，且地西他滨的作用依赖于MEG3的存在，提示地西他滨可能为治疗与MEG3表达缺失相关的肿瘤提供新的思路。

2.5MEG3与其他肿瘤 Tian等[33]发现骨肉瘤组织中的lncRNA MEG3表达显著降低。lncRNA MEG3低表达与晚期临床分期和远处转移密切相关，然而，lncRNA MEG3表达与其他临床特征(如性别、年龄、肿瘤大小和解剖位置)无关，表明lncRNA MEG3可能参与骨肉瘤的发生和转移。单变量分析显示，lncRNA MEG3表达、临床分期和远处转移与骨肉瘤患者的总体存活率显著相关，MEG3水平可能作为骨肉瘤患者预后不良的生物学标志物。Yang等[9]分析了33例睾丸生殖细胞肿瘤(testicular germ cell tumor，TGCT)样本中MEG3、miR-1297和PTEN的水平，发现MEG3水平显著降低，而miR-1297水平在TGCT中无变化，TGCT中PTEN蛋白而非mRNA水平显著降低。RNA免疫沉淀测试表明，miR-1297可与PTEN mRNA的3′非翻译区结合，而miR-1297也可与MEG3结合，在TGCT中MEG3可能作为内源竞争性RNA与miR-1297结合，通过对PTEN/Akt通路的影响发挥肿瘤抑制作用。Luo 等[3]通过qRT-PCR检测21例前列腺癌患者的MEG3表达水平，发现MEG3表达水平在前列腺癌组织中显著下降。与缺乏MEG3表达的细胞系HepG2细胞相比，两种雄激素依赖性前列腺癌细胞PC3和DU145表达更高水平的MEG3。 MEG3抑制PC3和DU145细胞的增殖、诱导细胞凋亡、诱导Bax蛋白表达、抑制Bcl-2和周期蛋白 D1表达、激活caspase-3。MEG3诱导的PC3和DU145细胞凋亡与Bcl-2蛋白的下调和Bax蛋白的上调有关。然而，Bcl-2和Bax mRNA的表达却无显著变化，故可推测MEG3是在转录后的修饰中起作用。MEG3在前列腺癌组织中显著下调，并在前列腺癌的发生和发展中发挥肿瘤抑制功能，为这种恶性肿瘤提供了一种潜在的有吸引力的治疗方法。Jia等[34]评估76对舌鳞状细胞癌(tongue squamous cell carcinoma，TSCC)和相邻组织学正常组织中miR-26a和MEG3的表达水平，发现肿瘤组织中miR-26a和MEG3的平均表达水平显著降低，两者表达水平呈正相关，且与总体存活率预后不良相关。荧光素酶分析显示，miR-26a可与DNMT3B的mRNA 3′非翻译区结合，miR-26a过表达的TSCC细胞中DNMT3B蛋白的表达显著降低。在SCC-15和CAL27细胞中增加外源miR-26a过表达或DNMT3B敲减时，内源性MEG3的表达增加。miR-26a或MEG3在TSCC细胞中的过表达抑制细胞增殖和细胞周期进程并促进细胞凋亡，表明这些因子在TSCC发病机制中起重要的抗肿瘤作用。miR-26a和MEG3可能作为TSCC患者临床预后的独立生物学标志物。

综上所述，MEG3在骨肉瘤中表达降低，且可能作为骨肉瘤预后不良的生物标志。TGCT中MEG3水平显著降低，MEG3可能作为内源竞争性RNA 影响PTEN/Akt通路并发挥肿瘤抑制作用。MEG3在前列腺癌组织中显著下调并可能在转录后水平起作用。在TSCC中miR-26a和MEG3的表达水平呈正相关，且其表达降低与不良预后相关，两者过表达抑制细胞增殖和细胞周期进程并促进细胞凋亡。总之，现研究表明MEG3在各系统肿瘤中表达下调，甲基化和表观遗传调控参与MEG3的沉默。

3 小 结

MEG3在多种肿瘤组织及细胞系中表达减低，且与其基因启动子处于高甲基化状态显著相关，MEG3的低表达与某些肿瘤TNM分期或预后不良相关，展现出其作为肿瘤诊断及判断预后标志物的潜力。MEG3低表达可能促进肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭的能力并可能抑制细胞凋亡，从而参与肿瘤发生、发展的生物学进程，而过表达MEG3可能通过转录调控或表观遗传学调控影响并调节Rb途径、p53途径、PTEN/PI3K/Akt途径、Wnt/β联蛋白信号通路，及与microRNA相互作用并靶向某些抑癌基因发挥肿瘤抑制作用。目前研究结果表明，MEG3有望成为肿瘤治疗的新靶标，并且近些年关于MEG3与某些microRNA相互作用的研究成为研究MEG3抗肿瘤作用机制的新热点，MEG3作为ceRNA在肿瘤抑制中发挥作用似乎出现更多的证据。然而，目前对于MEG3依然处于研究阶段，其在肿瘤中的具体作用机制尚期待更多的探索和挖掘。