CircRNAs在骨科常见病诊治中的研究进展

何 鹏，武振方综述，刘晓伟，许 斌审校

0 引 言

环状RNAs（circular RNAs，circRNAs）是一种广泛存在于真核细胞中的具有共价闭环结构的内源性特殊非编码RNA（noncoding RNA，ncRNA）［1］。早在1976年Sanger等［2］在研究类病毒RNA时首次在电子显微镜发现证实了circRNA存在，与常规病毒结构不同，其是一种无蛋白质外壳包裹的单链闭合的RNA分子，然而限于当时的检测方法及研究技术，发现初期并未引起人们的重视［3-4］。但随着高通量测序技术及生物信息技术的出现和广泛应用，学者们预测人体内至少存在约20 000种circRNAs，其数量超过相应线性RNA的10倍［3-5］。近年来大量研究发现circRNAs可特异性结合微小RNA（micro RNA，miRNA），通过其分子海绵机制参与调控靶基因的转录和表达，也可与RNA结合蛋白（RNA bindingproteins，RBPs）结合或直接翻译表达蛋白质在众多疾病中发挥生物学调控作用［6-11］。此外，越来越多的研究证实circRNAs在肿瘤（如鼻咽癌［7］、肺癌［12］、胃癌［13］、骨肉瘤［14］等）、心血管系统疾病［6］、神经系统疾病［15］以及运动系统疾病（骨关节炎［16］、腰椎间盘突出［17］）的发生发展和治疗中起着重要作用。本文就近年来circRNA在骨科系统疾病中的研究情况作一综述。

1 CircRNAs的生物学特性及功能

CircRNAs由3'和5'端相连形成共价闭合的环状结构，由于没有5'-3'的极性以及多聚腺苷酸尾结构，使得其可免受核酸外切酶或水解酶的降解，因而其在细胞内比线性RNA更加稳定［1，11］。CircRNAs一般由几百个核苷酸构成，可来源于基因组的各个片段，大多数circRNAs来源于外显子，主要分布在细胞质，而少数来源于内含子，主要存在于细胞核内。而根据序列形成和组合方式的不同，可将circRNA分为3种类型：外显子circRNA（exonic circRNA，ecRNA）、内含子 circRNA（ circular intronicRNA，ciRNA）和外显子-内含子circRNA（exon-introncircRNA，EIciRNA）。此外，circRNA还具有高度的物种保守性和时空特异性，各物种间遗传稳定性较好，在不同物种中存在较多相似序列，但在不同的组织中或同一组织不同的发育时期，circRNAs的种类和表达量亦千差万别［18-19］。

既往大量研究发现circRNAs可通过不同的分子机制在众多疾病的发生及发展中发挥重要的调控作用，其主要的分子功能为：①miRNA海绵，circRNAs内具有相同的miRNA响应元件（miRNA response element，MRE），可通过竞争性结合miRNA靶向调控目的基因的表达。CDR1as/ciRS-7是首个被发现具有miRNA分子海绵作用的circRNA，含有74个miR-7结合位点，其可通过竞争性结合miR-7而阻碍其目的基因的表达而发挥作用［20］。Zhang等［8］证实BMSCs细胞中circIGSF11能与miR-199b-5p结合，从而阻碍miR-199b-5p通过GSK-3β信号通路来调节BMSCs的分化及新骨形成；②直接与mRNA结合，circRNAs直接参与mRNA选择性剪接或转录的调控，如ci-ankrd52及ci-sirt7能够直接与polⅡ复合物相互作用，下调相关锚蛋白重复域52（parent gene ankrd52）或去乙酰化酶7的基因表达。EIci-RNA也可与小核糖体U1snRNP相互作用，继而与polⅡ结合促进亲本基因的转录［21］；③与RNA结合蛋白相结合，CDRlas可与miRNA作用因子Ago2蛋白结合共同发挥蛋白水解功能［22］。研究发现circRNAs还可与其他RNA结合蛋白结合形成稳定地的RNA-蛋白复合 体（RNA-protein complexes，RPCs），如 RNA quaking（QKI）、盲肌蛋白（muscle blind，MBL）、真核起始因子4A-III（EIF4A3）等；④直接翻译合成蛋白，circRNAs可作为翻译的模板指导蛋白质的合成，Wang等［23］在体外细胞实验中发现瞬时载入circRNA-GFP可直接转录翻译出完整功能的GFP蛋白。研究发现在真核细胞中乙型肝炎病毒的亚病毒卫星病毒能够以天然存在的circRNA形式编码出单一的蛋白质［24］；⑤circRNAs的其他功能：circRNAs能调控细胞间信号通路［25］、影响细胞分化［8］、形成假基因［26］及参与应激反应等，从而影响疾病的发生及发展过程。

2 CircRNAs与骨科相关疾病

2.1 CircRNAs与骨性关节炎骨关节炎（Osteoarthritis，OA）是一种由多种因素引起以关节疼痛为主要症状的退行性疾病，其病理特点为关节软骨变性坏死，滑膜炎性病变，骨赘形成。常好发于中老年人群，65岁以上的人群50%以上为OA患者，也是老年致残的主要因素之一。既往研究利用基因芯片或高通量测序技术在正常软骨和OA患者关节软骨中筛选出大量差异性表达的cirRNA并通过生物信息技术预测其靶基因、信号通路，构建共表达网络，为较多疾病的机制研究提供重要参考。Zhou等［9］将IL-1β诱导的大鼠OA模型组与正常对照组比较发现255种circRNAs出现了差异性表达，其中在OA模型组中有119种circRNAs表达上调，136种circRNAs表达出现了下调，并通过荧光定量PCR验证cirRNA-36866，cirRNA-33186，cirRNA-2443，cir-RNA-7063呈显著性上调，而cirRNA-30365，cirRNA-33736，cirRNA-2483呈显著性下调。也通过GO分析（Gene Ontology）和信号通路富集分析以及circRNA-miRNA共表达网络的构建来预测差异性表达circRNAs的功能。Liu等［27］在损伤软骨与正常软骨中筛选出104种差异性表达的circRNAs，其中44种circRNAs表达上调，60种circRNAs表达下调，并构建了包括45种circRNAs、42种miRNAs和42种mRNAs的circRNAs-miRNAs-mRNAs共表达网络，预测并验证了circRNAs-MSR可调控TNF-α的表达，也可参与软骨细胞外基质的降解过程。

学者们在基因芯片和高通量测序研究的基础上，对circRNA调控骨关节炎的具体机制特别是其在关节软骨细胞外基质（extra cellular matrix，ECM）调控方面也做了进一步的研究。ECM主要由聚集蛋白聚糖（aggregate proteoglycan，AGG）和Ⅱ型胶原（ColⅡ）组成，而基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）则是细胞外基质降解的催化酶。Liu等［28］发现circRNA-CER能作为miR-136海绵，上调MMP13表达，从而促进关节软骨细胞ECM的降解。Circ-0005105可通过竞争性结合miR-26a也可促使MMP13表达上调，同时抑制ColⅡ和AGG的表达，共同参与促进ECM降解过程［16］。众所周知，炎性因子白介素（IL）、肿瘤坏死因子、烟酰胺磷酸核糖基转移酶、内脂素等也在骨性关节炎的进展中起着关键的作用。研究发现Circ-0005105在促进软骨细胞ECM降解的同时也可促进PGE2、IL-6、IL-8和烟酰胺磷酸核糖基转移酶的生成，提示circ-0005105可能参与促进软骨细胞炎症反应的发生。Li等［29］发现circ-0045714可通过抑制miR-193b的转录活性，上调miR-193b的靶基因胰岛素样生长因子2受体表达，进而上调软骨细胞ColⅡ和AGG表达，提示circ-0045714可抑制软骨细胞的凋亡，为OA的治疗提供了新的思路。

2.2 CircRNAs与骨肉瘤骨肉瘤（Osteosarcoma，OS）是原发于骨髓腔的高度恶性实体肿瘤，起源于间叶组织，好发于10～20岁青少年，恶性程度高，易于复发和肺部转移，预后也较差。近年来研究发现circRNAs在骨肉瘤的发生与发展、迁移、恶变中发挥着重要作用。Chen等［14］将骨肉瘤细胞系（MG63，Saos-2及U2OS）与正常成骨细胞（hFOB）对比研究发现110种circRNAs呈差异性表达，骨髓瘤细胞存在8种circRNAs表达上调，102种circRNAs表达下调，通过生物信息分析预测circRNA-101391、circRNA-101139、circRNA-100413可能作为 miR-338-3p及miR-142-5p的分子海绵，进而上调细胞黏附因子1（cell adhesion molecules 1，CADM1）基因的表达。而CADM1作为一种新的抑癌基因，广泛参与细胞间黏附及信号转导，常在恶性肿瘤中呈现低表达，因而提示上述circRNAs可能为治疗骨肉瘤的新的方向。Zhang等［30］分别将骨肉瘤细胞与正常成骨细胞、30例骨肉瘤患者肿瘤标本与瘤旁正常组织对比研究发现circRNA-UBAP2在骨肉瘤细胞及骨肉瘤患者肿瘤标本中均存在明显过量表达，其表达量与肿瘤分级和患者生存时间也显著相关，进一步研究可知其能作为miR-143的分子海绵，促进细胞凋亡相关基因B淋巴细胞瘤-2的表达，抑制肿瘤细胞的凋亡，因而提示circRNA-UBAP2可能作为一种致癌基因在OS形成生长中起到促进作用。Deng等［31］研究认为circ-009910能作为miR-449a的分子海绵刺激激活IL-6R的表达，并通过调节JAK1/STAT3信号通路来调节骨肉瘤细胞的凋亡和坏死，因而提示circRNAs可能作为治疗骨肉瘤的潜在靶点。

而在治疗上虽然新辅助化疗使得骨肉瘤的5年生存率提高到50%以上，但随着生存期的延长，部分骨肉瘤患者对常规化疗药物会产生耐药，会造成肿瘤复发或转移，严重影响患者的生活质量及生存时间。Zhu等［25］通过比较80例术前采用2周期新辅助化疗（MTX，DXR，DDP，IFO）的骨肉瘤患者肿瘤标本及瘤旁正常组织发现circRNA-PVT1在OS组织中明显过量表达，并在体外细胞实验中将3组耐药骨肉瘤细胞株及非耐药骨肉瘤细胞株（MG63R vs MG63，U2OSR vs U2OS，KHOSR vs KHOS）及正常成骨细胞（hFOB）进行比较，发现六种骨肉瘤细胞株中circRNA-PVT1含量均明显高于正常细胞组，而3种耐药骨肉瘤细胞株的circRNA-PVT1含量亦明显高于非耐药骨肉瘤细胞株。将特异性靶向circRNAPVT1基因的siRNA转染入耐药性细胞株中（MG63R，U2OSR），耐药组骨肉瘤细胞株对化疗药物（DDP、DXR）的IC50值及耐药组细胞活力均明显降低，提示circRNA-PVT1能明显减弱骨肉瘤细胞的耐药性能。ATP结合蛋白亚家族1抗体（ATP-binding cassette sub-family B member 1，ABCB1）是 ABC转运蛋白超家族成员之一，研究发现其在人类多种肿瘤细胞（如卵巢癌、乳腺癌等）细胞中均过度表达并参与多种组织来源的肿瘤多药耐药的形成［32］。研究发现circRNA-PVT1能通过下调ABCB1基因的表达来削弱多耐药骨肉瘤细胞的耐药性能，可为耐药性骨肉瘤的治疗提供新的潜在靶点［25］。

2.3 CircRNAs与腰椎椎间盘退变腰椎间盘退行性疾病是骨科门急诊常见的以下腰痛为主要表现的疾病，其终生患病率可高达39%以上。研究发现circRNAs也参与椎间盘退变过程，在其疾病的发生发展以及治疗中也起着至关重要的作用。Zhou等［33］将退变的椎间盘与脊柱侧弯患者正常的椎间盘进行对比研究发现636种circRNAs出现了差异性表达，其中在退变的椎间盘组中有354种circRNAs表达上调，282种circRNAs表达出现了下调，通过RT-qPCR验证circRNA-103890的差异性表达，并利用生信分析预测circRNA-103890可能通过特异性位点与miR-185-5p结合进而调控其靶基因的转录翻译。Song等［34］将脊髓型颈椎病的椎间盘组织与平山病（hirayama disease）患者的椎间盘通过基因芯片技术筛选出792种circRNAs出现了差异性表达，实验组有428种circRNAs表达上调，364种circRNAs表达下调，进一步研究发现has-circRNA-104670的表达量与椎间盘Pfirmann分级有明显的线性相关性，也即退变分级越高，circRNA-104670的表达量越多。研究发现circRNA-104670能作为miR-17-3p分子海绵，竞争性抑制miR-17-3p靶基因的表达，进而使MMP-2的表达上调、COL-II的表达下调，因此提示circRNA-104670能竞争性结合miR-17-3p而促进ECM的降解进而参与椎间盘退变的发生及发展。Cheng等［17］发现circ-VMA21能抑制凋亡相关蛋白酶（caspase-3，caspase-7，caspase-9）以及细胞外基质降解酶（MMP-3，MMP-3，ADAMTS-4，ADAMTS-5）在髓核细胞的表达，同时也能促进COL-II及AGG的表达，进一步研究发现circ-VMA21作为分子海绵竞争性地与miR-200c结合，从而调节XIAP信号通路来参与椎间盘的退变过程。研究还通过向小鼠退变模型注射circ-VMA21验证其可减缓小鼠椎间盘退变模型椎间盘的退变，为椎间盘退变的相关疾病的治疗提供了新的方向。

2.4 CircRNAs与骨质疏松症骨质疏松症是一种老年人尤其是绝经后妇女常见的全身性骨代谢障碍性疾病，其特征是骨量减少和骨组织微结构破坏，从而致使骨脆性增加而极易发生骨折［35-36］。目前公认的骨质疏松症诊断标准是双能X线吸收检测法测量的结果，其诊断标准为T值≤-2.5。Jin等［37］将骨质疏松症患者与正常人血清样本进行对比研究发现骨质疏松患者中有106种circRNAs表达上调，154种circRNAs表达下调，其中差异性最为显著的 10种 circRNA分别为 circRNA-0010452、circRNA-0022348、 circRNA-0015566、 circRNA-0003323、circRNA-0013121和circRNA-0021739、circRNA-0011269、 circRNA-0019693、 circRNA-0005245、circRNA-0010349。Zhao等［38］将41例绝经后骨质疏松症患者与58例绝经后非骨质疏松症患者的血液进行分析，发现381种circRNAs出现差异表达的（203种上调和178种下调），并通过RT-qPCR证实circ-0001275在绝经后骨质疏松症组内呈高表达，线性回归分析提示circ-0001275与骨密度值呈显著相关性，其ROC曲线下面积为0.759，特异度和敏感度分别为0.853和0.664，因而circ-0001275可作为一种新型的诊断标记物应用于诊断绝经后妇女骨质疏松症。

众所周知，骨代谢是成骨细胞骨形成与破骨细胞骨吸收的动态平衡过程，成骨细胞减少或破骨细胞的增多致使该平衡被打破，易引起骨质疏松症。Dou等［39］研究发现circRNAs参与破骨细胞形成的过程，在前体期、成熟期和活化期均有不同种类的circRNA呈差异性的上调和下调，采用VENN分析发现在破骨细胞的3种状态下有24种相同的circRNAs均出现显著的差异性表达，并根据生信分析推测circRNA-010763可能与miR-103表达有关。随后研究也证实了circRNA-010763在绝经后的骨质疏松组患者中存在明显差异性表达现象［37］。由此可见circRNAs在骨质疏松症发病过程中发挥着至关重要的作用，同时外周全血中circRNA含量也高于相应线性RNA水平，同时自身环状结构使其拥有良好的稳定性，故有望成为骨质疏松症诊断的分子生物标记物。

3 结语与展望

CircRNAs本身特有的环状结构赋予了其独特的功能，越来越多的研究发现circRNAs在很多疾病的发生、发展、侵袭、恶变和转移等过程中都发挥着重要作用。但当前cirRNA在骨科疾病中的研究主要还是集中在其作为内源竞争性RNA（ceRNA）发挥分子海绵作用吸附miRNA进而影响靶基因的转录及翻译过程方面。而cirRNA参与调控mRNA选择性剪接或转录、与RNA结合蛋白相结合发挥蛋白降解功能以及直接翻译合成蛋白等其他的分子功能是否也参与骨科疾病的调控尚需进一步研究证实。circRNAs自身环状结构使其具有比miRNA和lncRNA较好的稳定性，随着对circRNAs的研究深入，笔者认为circRNAs终将在骨科疾病的发病机制、特异性诊断、靶向基因治疗等方面发挥其巨大的潜能。