外被体蛋白Ⅱ结构及囊泡形成的研究进展

李婉怡，丁 航，张志珍

(广东医科大学生物化学与分子生物学教研室，广东 东莞 523808)

在真核生物中，运输囊泡通过在不同细胞器及细胞表面转运发挥作用。目前已知的运输囊泡有网格蛋白囊泡、外被体蛋白(也称为衣被蛋白)(coat protein，COP)Ⅰ囊泡和COPⅡ囊泡，这些运输囊泡在细胞膜的生物合成、细胞器功能和形态的动态平衡以及蛋白质分泌等方面发挥作用[1]。早期分泌途径中，COPⅡ囊泡介导新合成的分泌性蛋白质和膜脂质等货物从内质网转运至顺面高尔基复合体(golgi apparatus，Golgi)；COPⅠ囊泡则介导货物分子从顺面Golgi逆向转运至内质网以及货物分子在Golgi膜囊间的转运[2-3]。晚期分泌途径中，含衔接蛋白(adaptor protein，AP)1、AP-3及AP-4蛋白复合物的网格蛋白囊泡可参与货物分子在反面Golgi与内体、溶酶体以及质膜间的转运[4-5]；含AP-2蛋白的网格蛋白囊泡参与货物的胞吞途径，通过质膜内陷形成囊泡，将细胞外或质膜表面的货物包裹到囊泡内，并转运至细胞内[6]。现就COPⅡ结构及囊泡形成的研究进展予以综述。

1 COPⅡ的分子组成、结构与功能

1.1COPⅡ复合物的组成 Matsuoka等[7]早期采用 X线晶体学，通过对COPⅡ复合物体外重构，解析出COPⅡ基本组成成分：小GTP酶蛋白Sar1，内衣被蛋白 Sec23和Sec24，外衣被蛋白Sec13和Sec31，这些成分以分层方式按顺序组装至内质网膜上，并介导COPⅡ囊泡的形成。Sar1以Sar1-鸟苷三磷酸(guanosine triphosphate，GTP)活化形式插入内质网膜内并与Sec23的trunk结构域结合，进而募集Sec23/Sec24复合体构成COPⅡ囊泡的内层；Sec23/Sec24复合体一侧弯曲并带正电荷，有利于该复合物与内质网膜结合，而Sec23通过与Sec31 C端富含脯氨酸的结构域结合，招募Sec13/Sec31复合体构成COPⅡ囊泡的笼型外层，并驱动内质网膜变形，最终形成COPⅡ囊泡；Sec13/Sec31复合体中Sec13的β-propeller结构域位于Sec31 N端β-propeller结构域和α-solenoid结构域之间；进一步研究发现，除上述核心成分外，Sec12和Sec16对COPⅡ囊泡的形成也至关重要[8]。

1.2COPⅡ的结构与功能

1.2.1Sar1 Sar1是一种与ADP-核糖化因子相关的GTP酶，是内质网上调节COPⅡ囊泡形成的核心参与者。Sar1有4个结构域：鸟嘌呤核苷酸结合口袋(G结构域)、开关Ⅰ、开关Ⅱ和N端双亲性α-螺旋，其中G结构域由6个β-折叠构成，并含有高度保守的核苷酸结合基序GxxxxGKT39，对于Sar1的功能至关重要；开关Ⅰ介导鸟嘌呤核苷酸和镁离子之间的相互作用；开关Ⅱ在GTP水解中起重要作用[9]。Sar1在细胞质以无活性的Sar1-鸟苷二磷酸(guanosine diphosphate，GDP)形式存在，通过内质网驻留蛋白——鸟嘌呤核苷酸交换因子Sec12催化，将GDP置换为GTP，形成活性的Sar1-GTP募集至内质网膜上；当Sar1与GTP结合时，Sar1的开关Ⅰ/Ⅱ区域构象发生变化，暴露Sar1的N端双亲性α-螺旋，螺旋的疏水残基与内质网膜中的磷脂基团相互作用而嵌入内质网膜中，介导内质网膜的弯曲，并降低内质网膜的刚性[9-10]。随着内质网膜曲率的增加，Sar1对内质网膜的亲和力增强，Sar1-GTP酶活性增加，而Sar1的GTP酶循环在COPⅡ囊泡形成中起正反馈作用[11]。插入内质网膜中的Sar1-GTP能够通过与Sec23结合募集内衣蛋白Sec23/Sec24复合物[1]。目前，Sar1介导COPⅡ复合物募集、囊泡形成的作用机制已明确，但Sar1对运载货物的浓度、COPⅡ囊泡出芽和断裂的调节作用仍有争议。Bacia等[12]认为，Sar1的GTP酶活性是COPⅡ囊泡从内质网膜处断裂的必要条件；而Adolf等[13]则认为，COPⅡ囊泡的断裂不依赖Sar1的GTP酶活性，且Sar1的GTP酶循环与COP Ⅱ 囊泡出芽以及COPⅡ囊泡装配的货物浓度无关。

1.2.2Sec23/Sec24异二聚体 内衣被蛋白Sec23、Sec24紧密结合形成蝴蝶结状异二聚体，该二聚体分子量约为200 000。插入内质网膜的Sar1-GTP通过与Sec23结合形成Sar1-Sec23/Sec24异三聚体作为COPⅡ囊泡内层的基本结构单元；多个Sec23/Sec24异二聚体的重复单元相互结合以近似螺旋管样排列，该结构不仅可以与货物蛋白、内质网膜、COPⅡ笼形外层结合，还决定了COPⅡ囊泡的形状；Sec23/Sec24异二聚体包含5个结构域：β-barrel、锌指结构域、trunk结构域、α-螺旋结构域和C端结构域[4,14]。一个异二聚体Sec23的C端结构域及锌指结构域与相邻异二聚体中Sec23的β-barrel结合，而来自同一异二聚体的Sec24的锌指结构与相邻异二聚体中Sec24的C端端结构域结合，结合部位表面带相反的电荷，有利于两个Sec23/Sec34复合物结构的稳定[1]。Sec23/Sec24中β-barrel与内质网膜大致平行；锌指结构与β-barrel结合构成Sec23/Sec24异二聚体边缘部分；trunk结构域插入β-barrel之间，并提供Sec23与Sec24结合的接口；α-螺旋结构域是由螺旋α K-L-M形成的三螺旋束和螺旋N、O、S组成，其中αL朝向内质网膜，αM和αN与Sar1结合；C端结构域是由Sec23和Sec24中105个连续氨基酸残基构成，并与α-螺旋结构域相结合，C端结构域是5种结构域中唯一不参与COPⅡ内层构成的结构域，主要在Sar1与核苷酸之间起催化作用，并在远离内质网膜的方向延伸形成了与Sec31的结合位点，从而对COPⅡ笼形结构进行调整，以适应不同大小和形状的货物装配[14]。此外，Sec23的trunk结构域与Sar1结合，Sec23是Sar1的GTP酶激活蛋白，通过与Sar1-GTP结合加速GTP水解；Sec24携带多个与货物或货物蛋白受体的结合位点，目前已发现酵母Sec24的3个结合位点(A、B、C位点)，每个位点都可识别不同的内质网输出信号，其中A位点通过疏水口袋与酵母Sed5p上的YXXXNPF基序结合，B位点与酵母Sys1的DXE、Sed5的LXXME及Bet1的LXXLE基序结合，C位点通过构象表位与可溶性N-乙基马来酰亚胺附着受体(soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor，SNARE)蛋白Sec22结合[15-16]。

1.2.3Sec13/Sec31异四聚体 Sec31主要由N端WD40结构域和C端ACE1结构域构成，其中WD40结构域包含7个β-propeller，ACE1结构域主要包含一系列α-solenoid，并在C端存在脯氨酸序列；Sec13主要包含6个β-propeller，通过与Sec31第7个β-propeller结合，插入Sec31的WD40结构域和ACE1结构域之间而形成Sec13/Sec31异二聚体[15]。2个Sec13/Sec31异二聚体通过Sec31 C端ACE1结构域结合形成1个Sec13/Sec31棒状异四聚体，作为COPⅡ外层基本结构单元；4个Sec13/Sec31异四聚体通过Sec31 N端的β-propeller相互接触构成X型，并形成COPⅡ的一个顶点[1,15]。COPⅡ囊泡能够不依赖内质网膜在体外进行装配，利用这一特性，借助冷冻电子显微镜解析了COPⅡ囊泡的结构：Sec13/Sec31异四聚体可单独装配形成正八面体球状笼型，平均直径为60 nm；Sec13/Sec31和Sec23/Sec24共同装配可形成平均直径60～100 nm的笼型结构，其中最大可形成二十面体球状笼型；在COPⅡ笼型结构中，相对于立方体的顶点，Sec13/Sec31异四聚体构成的顶点位于偏心的位置，即异四聚体的一端比另一端更靠近顶点，从而在边缘产生极性，靠近顶点的一端称为正端，另一端称为负端，以维持COPⅡ囊泡的几何形状[1,9]。Sec13/Sec31异四聚体正端和负端在顶点处的几何关系可以用两个角度来描述：从正端到负端的顺时针角称为α角，而由负端到正端的顺时针角称为β角，通过改变β角可产生不同大小的COPⅡ笼型[16]。利用冷冻透射电子显微镜进一步观察发现，COPⅡ笼型可根据内质网膜的形状将COPⅡ囊泡装配为球型或管型囊泡，在球型COPⅡ囊泡中，α角始终为60°，β角在90°～108°变化，而管型COPⅡ囊泡的α角和β角分别为80°和96°；另外，在球型囊泡中，单个Sec13/Sec31异四聚体一端为负一端为正，而管型囊泡单个Sec13/Sec31异四聚体两端同为正端或负端[1,17]。Sec13/Sec31复合体具有自我组装成不同几何形状的特性，Sec13/Sec31复合物通过Sec31能够与Sar1-Sec23/Sec24组成的出芽前复合物结合，并使内质网进一步弯曲与内质网膜分离，形成包被有货物的一个完整囊泡；不同于 COPⅠ 囊泡，COPⅡ不需要特殊的GTP酶来收缩形成囊泡的颈部，并将包被有货物的COPⅡ囊泡从内质网膜中释放出来[18]。Sec31可加速Sec23水解GTP酶，有利于COPⅡ囊泡的形成。Sec31 C端的氨基酸序列可根据COPⅡ囊泡装配的货物大小调节COPⅡ笼型的柔性和刚性，灵活装配成不同几何形状的COPⅡ笼型，从而使COPⅡ囊泡容纳比自身更大的货物(如前胶原、乳糜微粒等)，这可能与Sec31的泛素化有关[15]。

2 COPⅡ囊泡的形成及运输

2.1COPⅡ在内质网膜上的装配 在真核生物中，约有1/3蛋白质的早期分泌途径依赖COPⅡ囊泡的运输；在酵母细胞中，COPⅡ囊泡在内质网形成，而在大多数真核生物中，COPⅡ囊泡在过渡内质网或内质网输出位点形成，以哺乳动物细胞COPⅡ复合物的装配为例：COPⅡ的装配起始于Sar1的活化，Sar1-GDP在Sec12催化作用下转变为Sar1-GTP，活化后的Sar1构象发生变化，暴露其N端的α-螺旋，从而插入内质网膜内；Sar1-GTP通过与Sec23结合将COPⅡ内衣被Sec23/Sec24异二聚体募集至内质网膜，Sec24携带与货物蛋白受体或跨膜蛋白的结合位点，通过捕获正确折叠和组装的货物分子进行货物分选[1,14]。Sar1-Sec23-Sec24与蛋白质/脂质等货物分子结合后形成前出芽复合物，该复合物可启动内质网膜的正性弯曲[14]。随后，Sec23与Sec31 C端富含脯氨酸的结构域结合，从而招募Sec13/Sec31复合体聚合形成COPⅡ笼型结构，以适应不同大小的货物分子，通过上述过程，COPⅡ装配至内质网膜上并形成COPⅡ囊泡[1,14]。这一装配过程不同于COPⅠ囊泡，COPⅠ的cage亚复合物和adaptor亚复合物是在胞质形成异七聚体的蛋白质复合物后，以整体形式被募集至Golgi膜上[18]。Sec23是Sar1-GTP的GTP酶激活蛋白，而Sec31可增强Sec23的GTP酶活性，从而加快GTP水解，诱导内质网膜的断裂驱使COPⅡ囊泡释放，并将货物运输至各个靶器官[19-20]。大部分蛋白质和超过COPⅡ囊泡本身大小的大分子货物(如前胶原或乳糜微粒等)均可通过COPⅡ囊泡完成运输[21]。

2.2COPⅡ参与的货物分选

2.2.1货物分选方式 货物分选是指依赖于受体、衔接子和COPⅡ被膜组分识别出正确折叠和组装的货物，在内质网输出位点处装载入COPⅡ囊泡，并选择性地从内质网输出的过程。内质网输出位点或过渡内质网是内质网上用于货物输出的专门区域，内质网输出位点是一种富含COPⅡ主要成分和Sec16的特殊部位[22]。货物需经过正确折叠和组装后选择性地进行输出，并留下内质网驻留蛋白。理论上讲，任何定位于内质网的货物均可通过批量运输的非特异性方式包裹至COPⅡ囊泡中，并随 COPⅡ 囊泡出芽扩散输出，该途径运输速度快但效率低，且对蛋白质的分泌起作用较小；大多数膜蛋白和可溶性货物蛋白以主动分选的选择性运输方式包裹至COPⅡ囊泡中，该方式运输的货物浓度比批量运输方式高3～50倍，选择性货物捕获由内质网输出信号驱动；大多数跨膜货物可与COPⅡ直接结合，少数跨膜货物和多数可溶性蛋白通过跨膜货物受体或衔接子间接与COPⅡ结合，而缺乏回收信号的未成熟的蛋白质则不能被批量运输[23]。

2.2.2货物分选所需的内质网输出信号 不同的跨膜蛋白货物存在多种分选信号序列，介导了货物与COPⅡ结合并驱使货物的运输。这些分选信号序列是存在于蛋白质一级结构中的短线性序列，可用于指导货物在内质网上的合成，并在合成结束前被切除。已在不同生物的跨膜货物蛋白上鉴定出几类内质网输出信号，如水疱性口炎病毒糖蛋白、哺乳动物Kir2.1钾通道蛋白、酵母Sys1p和Gap1p细胞质区域的含酸性氨基酸残基的基序D/E-X-D/E，上述内质网信号序列是内质网运输货物所必需的；在蛋白质货物C端或其附近的两个相邻疏水性氨基酸残基组合的基序(FF、YY、LL或FY)属于第二类内质网输出信号，这些信号存在于p24家族蛋白和Erv41/46复合体中[16]。除上述基序外，在ERGIC(ER-Golgi intermediate compartment)-53/上皮膜蛋白-47家族蛋白C端也发现了含酪氨酸基序的内质网输出信号；另外，在几种酵母SNARE蛋白的胞质结构域也鉴定出输出信号，如酵母Sed5上的YXXXNPF、LXXME基序以及在Bet1上的LXXME基序等[15-16]。

少数跨膜蛋白和多数可溶性蛋白的内质网输出需要特定的跨膜货物受体或衔接子间接与COPⅡ亚基的结合，如哺乳动物中ERGIC-53是部分糖蛋白(如糖蛋白凝血因子、组织蛋白酶C和组织蛋白酶Z)装配至COPⅡ囊泡所必需的；酵母中Erv29是将糖基化α因子前体有效装配入COPⅡ囊泡和有效分泌羧肽酶Y所必需的[16]。

2.2.3大分子货物分选 一般来说，COPⅡ囊泡直径为60～90 mm，前胶原、乳糜微粒及载脂蛋白等大分子货物远远超过COPⅡ囊泡的大小，但仍可以在内质网输出位点处依赖COPⅡ囊泡进行分泌[1]。大分子货物分选主要涉及货物如何装配入COPⅡ囊泡以及囊泡被膜如何增加尺寸以容纳大分子货物。大分子货物的装载主要由转运和Golgi组织蛋白1(transport and Golgi organization protein 1，TANGO1)介导，而E3泛素连接酶和其配体衔接蛋白KLHL12以及泛素化的Sec31可增加COPⅡ囊泡被膜尺寸[24]。TANGO1通过与Sec16结合定位于内质网输出位点处，两者的结合对于维持COPⅡ组分是必需的[25]。TANGO1也可以作为货物的受体，以环状形式装配在COPⅡ周围，环状TANGO1伴随内质网中大分子货物的输出而收缩[26]。TANGO1包含多个结构域：SH3结构域、跨膜结构域、2个螺旋结构域和脯氨酸结构域，其中脯氨酸结构域与内质网输出位点和COPⅡ的Sec23结合，SH3结构域可与胶原、载脂蛋白及乳糜微粒等大分子货物结合，如SH3结构域通过与胶原的特异性分子伴侣人热激蛋白47结合将大分子货物定位于内质网输出位点处[24]。TANGO1能在内质网输出位点处与其同源物皮肤T细胞淋巴瘤相关抗原5结合，T细胞淋巴瘤相关抗原5可以作为TANGO1的共同受体，通过募集Sec12从而招募更多的COPⅡ组分[24,27]。TANGO1还能够招募Sedlin蛋白，Sedlin蛋白能促进Sar1-GTP水解，从而促进大分子货物的输出[28]。Sec31的泛素化对COPⅡ囊泡被膜尺寸也起重要作用，但具体机制尚不清楚。研究显示，E3泛素连接酶通过配体衔接蛋白KLHL12可使Sec31泛素化，修饰后的Sec31可招募有利于形成管状 COPⅡ 衣被结构的其他因子，且Sec31的泛素化还可以调节Sec23的活性，以激活Sar1-GTP的GTP酶水解活性[29]。

2.3COPⅡ囊泡的出芽 活化的Sar1-GTP介导内衣被Sec23/Sec24复合物和外衣被Sec13/Sec31分步募集至内质网膜上，并分选装载货物形成笼型结构，诱导内质网膜正性弯曲形成出芽[1]。在COPⅡ囊泡形成的后期，内质网膜以负性弯曲为主，出芽的COPⅡ装配复合物逐渐收缩形成狭窄的颈部，初级COPⅡ囊泡脱离内质网膜；与其他囊泡出芽依靠动力蛋白家族不同，COPⅡ囊泡是由自身组分Sar1驱动的，Sar1可使脂质变形为细长小管，Sar1的α-螺旋是COPⅡ茎部收缩和断裂所必需的；另外，对囊泡结构的研究已经证明，Sec23/Sec24复合物具有与囊泡大小相匹配的凹面，有助于内质网膜的弯曲[14]。研究表明，定位于过渡内质网或内质网输出位点处的Sec16在COPⅡ装配过程中起支架蛋白的作用，有利于COPⅡ组分的集中招募，并可通过调节Sar1活性使COPⅡ囊泡完成被膜装配和货物装载后再出芽[30]。目前，有关Sar1-GTP水解在COPⅡ囊泡出芽过程中作用说法不一，有研究认为，GTP水解是COPⅡ囊泡形成和供体膜断裂所必需的，而有的研究则认为，Sar1-GTP中小GTP酶促进囊泡从膜上分离不依赖于GTP水解而与自身寡聚化有关[31]。

2.4COPⅡ囊泡与靶膜融合 在哺乳动物细胞中，从内质网释放的COPⅡ囊泡被运输至前Golgi或ERGIC，货物在ERGIC处由COPⅠ囊泡介导，继续正向运输至Golgi或逆向回收至内质网中；但在酵母和植物细胞中，由于缺乏ERGIC，从内质网释放的COP Ⅱ 囊泡快速扩散并直接与早期Golgi融合[15]。在COPⅡ囊泡与靶膜融合过程中，需经过靶向、栓系、脱壳以及融合等阶段。COPⅡ囊泡与靶膜融合在酵母细胞中研究较多，出芽后COPⅡ囊泡的Sec23以分层的方式与Sar1、转运蛋白颗粒Ⅰ(transport protein particle Ⅰ，TRAPP Ⅰ)、Hrr25相互作用，有利于囊泡正向运输至靶膜，防止囊泡逆向运输回内质网[32]。TRAPPⅠ是一种鸟嘌呤核苷酸交换因子，TRAPPⅠ与Sec23的结合，启动了COPⅡ囊泡与Golgi的栓系；TRAPPⅠ募集并激活Rab蛋白家族中Ypt1的GTP酶活性，Ypt1-GTP可将Uso1募集到囊泡中，Uso1是囊泡从内质网运输至Golgi中的一种系链蛋白，当Uso1弯曲时，COPⅡ囊泡接近靶膜，触发囊泡释放TRAPPⅠ；Hrr25可与TRAPPⅠ竞争结合Sec23，促进了TRAPPⅠ的释放，同时Hrr25与Sec23结合可使Sec23磷酸化，进而阻断COPⅡ囊泡与TRAPPⅠ的结合[15,32]。目前有关COPⅡ囊泡脱壳以及与靶膜融合的机制尚不十分清楚。研究表明，Trk融合基因通过与Sec31竞争结合Sec23，将COPⅡ囊泡被膜外层置换，并将仅包被内层的COPⅡ囊泡聚集，直至COPⅡ被膜组分解离并暴露膜蛋白SNARE分子，从而与靶膜融合[33-34]。COPⅡ囊泡与靶膜融合是由一类高度保守的SNARE蛋白家族催化，在出芽前囊泡中的Sec23与v-SNARE结合，并在运输时与靶膜上的t-SNARE结合，从而完成融合过程[34]。

3 小 结

COPⅡ囊泡介导的货物转运是一个复杂精细的动态过程，目前对于COPⅡ的研究仍有很多方面尚不清楚：COPⅡ囊泡形成的详细调控机制、COPⅡ囊泡在货物装配过程中是否还存在其他货物分选信号、是否存在除COPⅡ以外的其他物质参与大分子货物的运输、COPⅡ囊泡从内质网断裂到与靶膜融合过程中还受哪些因素的影响等。蛋白质/脂质货物从内质网至Glogi的正向转运依赖COPⅡ囊泡，而从Glogi至内质网逆向运输依赖COPⅠ囊泡。尽管两类囊泡均参与货物分泌途径并且在功能上有许多相似之处，但它们的结构和装配模式明显不同。COPⅠ囊泡的β-COP亚基参与高密度载脂蛋白A-1介导的胆固醇逆向转运[35]。而COPⅡ囊泡作为货物顺正向运输的关键，其各组分在胆固醇转运中的具体作用及相关机制还有待深入研究。