虎源大肠杆菌ESBLs基因型的检测

牛鑫鑫 冯 涛 何纪元 薛 原 曾祥伟

(东北林业大学野生动物资源学院，哈尔滨，150040)

超广谱β-内酰胺酶(Extended-spectrumβ-lactamases，ESBLs)，是指细菌产生的能水解β-内酰胺类抗菌药物的灭活酶，能通过接合、转化和转导等形式使耐药基因在细菌中扩散，是细菌对β-内酰胺类抗菌药物耐药的主要机制[1]。1983年，产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的克雷伯菌(Klebsiellaspp.)首次在德国报道后，产ESBLs细菌的流行在世界范围被广泛报道[2]。ESBLs主要存在于临床分离的革兰阴性杆菌，其中以肠杆菌科(Enterobacteriaceae)大肠埃希菌(Escherichiacoli)和克雷伯菌最为常见[3-5]。研究证实，产ESBLs菌具有交叉耐药和多重耐药性，易导致耐药菌的传播和获得性感染的暴发，目前产ESBLs 菌株的广泛流行和传播已成为临床治疗的突出问题[1，6]。

细菌在持续的各种β-内酰胺类抗菌药物的选择和进化压力下，被诱导产生活跃且不断变异的β-内酰胺酶。统计发现，已有超过400种的ESBLs型别被报道，但不同国家或地区对抗菌药物的使用剂量、时间、临床经验用药差异，导致基因型及基因亚型也存在明显差异[7]。其中主要流行的是 TEM 型、SHV 型、CTX-M 型和OXA 型 ESBLs[8]。近年来，CTX-M 型传播迅速，已经开始替代TEM 型和SHV 型成为全世界最流行的ESBLs。我国的报道也显示，CTX-M 型正逐渐占据主导地位，这一现象，可能与临床治疗肠杆菌感染时头孢噻肟比头孢他啶运用更多且用量更大有关[9]。大肠杆菌(Escherichiacoli)是产ESBLs的主代表菌株[10]。

东北虎林园是世界上最大的东北虎饲养和繁育基地、国家东北虎种源繁育基地、国家级陆生野生动物疫源疫病监测站。因此，开展产ESBLs虎源大肠杆菌耐药性流行病学调查与优势基因型分析，为阐明虎源大肠杆菌耐药与产酶关系，控制ESBLs 菌株在虎群感染和流行，指导临床合理使用抗菌药物有重要意义。本研究调查了东北虎林园中虎源大肠杆菌中不同型别ESBLs的流行情况，为明确菌株耐药基因潜在的播散趋势，有效监控细菌耐药性，指导东北虎的疾病防治用药，有效保护东北虎的种群奠定基础。

1 研究方法

1.1 细菌的分离、纯化培养及药敏实验

将从东北虎林园中采集的粪便样本，接菌划线于麦康凯琼脂平板，于37 ℃恒温培养；挑取上述培养体系中单个红色可疑菌落，划线于伊红美蓝琼脂平板，仍于37 ℃恒温培养；对上述培养体系中可疑紫黑色带金属光泽菌落进行抹片、革兰氏染色，镜检。鉴定为大肠杆菌的菌株，在无菌环境下，接种于普通肉汤培养基，37 ℃进行恒温纯培养。实验采用药敏片见表1。

表1 实验使用药敏片名录

Tab.1 Drug sensitive tablets list in this study

注：CAZ，CTX，购自北京天坛药物生物技术开发公司；其余药敏片购自杭州天和微生物试剂有限公司和OXIOD公司

Note：CAZ，CTX，purchased from the Beijing Tiantan Pharmacy Biological Research & Development Company.Others are from Hangzhou Tianhe Microorganism Reagent Co.，Ltd.and OXIOD company

1.2 细菌ESBLs检测

按照CLSI标准进行操作和观察判断[11]。

1.2.1 初步筛选实验

初筛试验采用纸片扩散法，结果判定标准：CAZ≤22 mm，CRO ≤25 mm，CTX≤27 mm，AZT≤27 mm，样本即为产ESBLs菌株。实验阴性对照：大肠杆菌ATCC25922。

1.2.2 表型确证试验

实验需将受试菌均匀涂布在M-H 琼脂平板上，分别贴CAZ、CAZ/Clav 和CTX、CTX/Clav 两组纸片，之后于37 ℃恒温培养16 h，若任一组加克拉维酸比不加克拉维酸的抑菌圈直径≥5 mm，即可确认为产ESBLs菌株。

1.3 ESBLs基因的PCR 扩增及序列分析比较

1.3.1 引物的设计合成

实验引物参考Van等设计的引物[12]，引物合成由上海英骏生物技术有限公司完成。

1.3.2 PCR扩增模板的制备

将30株虎源大肠杆菌分别接种于的LB琼脂培养基，过夜培养；挑取单个菌落接种于LB 液体中，37 ℃恒温摇床孵育12 h，使用按吸附柱式质粒小量抽提试剂盒提取质粒DNA。

1.3.3 不同型ESBLs基因的PCR检测

使用PCR扩增试剂盒(TakaRa公司)，进行SHV、CTX-M、TEM、OXA基因的PCR检测。

PCR扩增体系为25 μl：Taq酶 0.25 μL，dNTP 2 μL，10×buffer 2.5 μL，模板DNA 1 μL，上下游引物各0.5 μL，去离子水18.25 μL。

反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性1 min，退火1 min，退火温度56.5℃，72℃延伸1 min，30个循环反应循环，72℃延伸5 min。

2 结果

2.1 ESBLs检测结果

ESBLs检测结果显示，各药对质控菌的抑菌圈均符合CISI 规定的标准。初筛检测试验中，21株大肠杆菌为疑似产ESBLs 菌株。经过确证试验，21株疑似株均为产ESBLs菌株，阳性率为70%。

2.2 SHV、CTX-M、TEM 、OXA基因的检测结果

PCR结果显示：30株虎源大肠杆菌中，blaTEM基因阳性率为80%，阳性菌株24；blaCTX-M基因阳性率为50%，阳性菌株15；blaSHV基因阳性率为6.67%，阳性菌株2；blaOXA基因阳性率为20%，阳性菌株6。

图1 blaCTX-M基因PCR扩增结果Fig.1 PCR amplification product of blaCTX-M geneM.Marker 2kb；A.阴性对照；B-F.blaCTX-M基因M.Marker 2kb，A.negative control，B-F.the result of blaCTX-M gene

图2 TEM基因PCR扩增结果Fig.2 PCR amplification product of TEM geneM.Marker 2kb；A.阴性对照；B-D.TEM基因M.Marker 2kb，A.negative control，B-D.the result of TEM gene

图3 SHV基因PCR扩增结果Fig.3 PCR amplification product of SHV geneM.Marker 2kb；A.阴性对照；B.SHV基因M.Marker 2kb，A.negative control，B.the result of SHV gene

图4 OXA基因PCR扩增结果Fig.4 PCR amplification product of OXA geneM.Marker 2kb；A.阴性对照；B-G.OXA基因M.Marker 2kb，A.negative control，B-G.the result of OXA gene

2.3 药敏实验结果

实验结果显示：对β-内酰胺类药物，产酶菌(21株)比不产酶菌(9株)的耐药率高，其中产酶菌对AMP耐药率最高，为100 %。9株非产酶菌对AZT高度敏感。不同抗菌药对30株虎源大肠杆菌耐药率见图5。

图5 30 株虎源大肠杆菌对抗菌药药敏试验耐药率Fig.5 Antibiotic susceptibility and resistance rates of 30 E.coli strains form tiger against agents

3 讨论

抗生素和各类化学合成药物的使用和推广，对人类和动物的医疗发展进程起到了积极重要的推动作用。然而，由于抗菌药物的不合理使用，使细菌耐药性和多重耐药菌的出现成为临床疾病防治中的重要难题。细菌产生耐药性的机制有多种，其中产生超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)，并由质粒介导传播是导致革兰阴性菌对β-内酰胺类抗菌药物耐药性产生和扩散的重要机制[1，13]。自1983年，首例产ESBLs的克雷伯菌在德国报道后，产ESBLs菌株在世界范围被广泛发现和报道，其中以肠杆菌科的大肠埃希菌和克雷伯菌最为常见[6]。ESBLs能水解3代头孢菌素和单环酰胺酶类，但能被BIA抑制剂所抑制[13]。值得关注的是，产ESBLs细菌株携带的质粒可能同时带有氨基糖苷类、氯霉素、四环素、磺胺类和氟喹诺酮类等多种药物的耐药基因[14]，使其具有多重耐药表型，使病原菌株拥有更大的扩散优势，从而严重威胁临床治疗。

近年来，各地产ESBLs菌株的检出率更是逐年上升，渐呈世界性流行的趋势，但不同地区流行的基因型存在明显差异[13]。例如，Fortini 等[15]研究表明尼日利亚健康鸡和猪中ESBLs流行主要为TEM基因；Guenther 等[16]研究显示蒙古和德国野生鸟类中ESBLs流行主要为CTX-M型；而在中国，苑丽等[17]研究发现，在河南省的鸡群中TEM和CTX-M基因型均有流行；Liao等[18]研究进一步证明，中国病死家禽中ESBLs流行以CTX-M型为主，且以CTX-M-27 型最为流行。Livermore等[19]研究则发现欧洲各国产ESBLs耐药菌的类型正逐渐从以TEM、SHV型变为以CTX-M型为主。目前，对耐药性检测主要集中在家畜家禽的研究，国内对野生动物和圈养野生动物的ESBLs检测工作较少，而开展ESBLs监测，有效掌握多种耐药基因的流行情况，防止耐药菌株的扩散爆发，对指导临床有效用药，保护濒危物种是非常必要的。

东北虎林园是为挽救和保护世界濒危物种东北虎而建立，为了更好地了解产ESBLs菌株在东北种群中流行情况，本实验对30株虎源大肠杆菌进行了检测。结果显示，30株虎源大肠杆菌中，有21株为产ESBLs菌株，阳性率高达70%。其中，TEM基因检出的阳性例数为24例，阳性率达80%，是东北虎林园主要的β-内酰胺酶型别。与许颖等[20]的研究结果：产ESBLs大肠杆菌主要型别为TEM型，其对青霉素类抗生素具有较强耐药性的结果类似。CTX-M基因的检出率为50%，是仅次于TEM型的主要流行基因亚型。SHV型基因主要位于克雷伯菌中，本次实验SHV基因的检出率仅为6.67%。OXA型ESBLs国内外文献报道主要存在于铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌中[21]，而在肠杆菌科细菌中所占比例较少，国内相关报道也较少，但是本研究发现OXA型基因在东北虎林园中检出。另外，对比发现，产酶大肠杆菌比非产酶大肠杆菌的耐药性更高。应加强对东北虎林园菌株耐药性监测，探索耐药基因的分子流行病学规律，严格掌控抗菌药物使用，从而有效降低动物感染的概率。建议采用定期轮换药物的方式用药，以避免耐药性的产生和扩散。