气道平滑肌细胞增殖的分子机制研究进展

冯 丹，霍 炎

(上海交通大学附属第六人民医院药剂科，上海 200233)

近年来，哮喘的发病率明显升高，长期迁延不愈可导致肺气肿、肺源性心脏病等严重疾病。哮喘是临床常见的慢性气道炎症疾病，以气道高反应性和气道重构为主要特征，其中慢性炎症所致的气道重构是导致不可逆性气道阻塞以及气道高反应性持续恶化的重要病理改变。哮喘气道重构的因素众多，包括多种免疫细胞浸润、上皮损伤、纤毛功能障碍、杯状细胞增生、网状层和网状基膜厚度增加、血管分布增加、上皮下纤维化以及纤维细胞和气道平滑肌细胞(airway smooth muscle cells，ASMCs)的增生肥大[1-2]。由ASMCs构成的气道平滑肌是构成气道壁的重要结构，参与气道重构的发生与发展，而气道平滑肌增厚亦是哮喘气道重构的重要特征。正常人体ASMCs多为收缩表型(正常表型)，维持气道的正常功能，而哮喘患者的ASMCs在多种因素刺激下可发生表型改变，主要表现为过度增殖等导致的气道重构，造成哮喘患者气道狭窄和气道高反应性的进一步恶化[3]。因此，防止和减轻气道重构是哮喘防治的重要策略。ASMCs是气道重构的重要特征，现就影响ASMCs增殖的因素及其相关信号通路予以综述，以进一步了解ASMCs增殖在气道重构中的作用。

1 气道结构及ASMCs细胞学基础

气道结构从内到外依次是黏液细胞、上皮、上皮下区域、成纤维细胞、气道平滑肌层及外膜，在较大气道中还包含软骨。随着气道分支的增多，软骨占气道组织的比例逐渐减少，而平滑肌占气道组织的比例逐渐增多，约占小气道(内径<2 mm)组织的100%[4]。

正常人体气道的ASMCs为收缩表型，主要通过收缩和舒张气道来调控气流。ASMCs是α-平滑肌肌动蛋白阳性细胞，表达各种收缩蛋白，其中主要的收缩蛋白包括平滑肌肌球蛋白轻链激酶、肌球蛋白重链、肌动蛋白和其他蛋白，如转胶蛋白、CD38、组胺H1受体和其他无关收缩蛋白质。平滑肌肌球蛋白轻链激酶是一种Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶，是调节ASMCs收缩的主要酶类。刺激平滑肌细胞后，Ca2+由细胞外液进入胞内或通过1,4,5-三磷酸肌醇的作用从细胞内储库中释放，使细胞内液Ca2+瞬时升高，随后，Ca2+/钙调蛋白复合物激活平滑肌肌球蛋白轻链激酶，磷酸化20 kD肌球蛋白调节轻链，导致肌球蛋白ATP酶激活，并引发收缩[5-6]。α-平滑肌肌动蛋白是最重要的肌动蛋白，通常作为成熟的、可收缩的平滑肌细胞标志，用来鉴别平滑肌细胞[7]。当ASMCs发生增殖时，α-平滑肌肌动蛋白和CD38的表达水平升高，细胞内钙信号发生变化，收缩蛋白平滑肌肌球蛋白轻链激酶和肌球蛋白重链也发生相应变化，气道收缩性发生改变[8-13]。

此外，ASMCs也是影响气道重构的主要因素。ASMCs过度增殖可导致气道平滑肌层增厚，占据气道更大空间；还可分泌炎症因子进一步参与气道重构。哮喘的严重程度也与气道壁内ASMCs的数量相关[14]。气道平滑肌层增厚为确定哮喘的标志，在致命性哮喘或严重哮喘中尤为明显。在无任何刺激因素时，哮喘患者ASMCs的体外增殖速度远远超过非哮喘患者，与非哮喘患者正常气道平滑肌层厚度相比，致命哮喘患者气道平滑肌层厚度增加50%～200%，而非致命哮喘患者增加25%～55%[15]。

2 影响ASMCs增殖的因素

ASMCs过度增殖是哮喘气道重构的最显著特点，可使气道收缩能力增加，气道壁增厚，导致严重的气流受限及气道高反应性。了解影响ASMCs增殖的因素对哮喘的防治至关重要。研究表明，体内外大量的促有丝分裂因子可促进ASMCs增殖，包括生长因子、细胞因子与炎症介质、酶与细胞外基质 (extracellular matrix，ECM)、微RNA(microRNA，miRNA)及其他因素等。

2.1生长因子/炎症介质/细胞因子 血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor，PDGF)-BB通过激活胞外信号调节激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)1/2、 p38和c-Jun氨基端激酶通路以及促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)通路，上调Wnt/β联蛋白信号转导通路，增加细胞周期蛋白D1的表达等多种信号通路，促进ASMCs增殖[16-19]。体外研究表明，转化生长因子-β1以浓度和时间依赖方式促进ASMCs增殖，与正常大鼠相比，哮喘大鼠的ASMCs会分泌更多的转化生长因子-β1，转化生长因子-β1又进一步诱导哮喘大鼠ASMCs的增殖[20-22]。血管内皮生长因子也在哮喘气道重构的过程中起重要作用。有研究表明，血管内皮生长因子可通过促进解整合素金属蛋白酶33的表达，增强ASMCs的增殖[23]。此外，脑源性神经营养因子以及一系列炎症刺激因子也可诱导ASMCs的增殖，包括经典的Th1型和Th2型细胞因子(如肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-4、白细胞介素-13和白细胞介素-5)以及胸腺基质淋巴细胞生成素、白细胞介素-6和Th17家族细胞因子等[24-25]。

另有研究显示，ASMCs还可通过分泌一些炎症因子(如细胞黏附分子-1、血管细胞黏附分子-1和CXC趋化因子配体10等)招募肥大细胞和T细胞进入气道平滑肌层，进而促进ASMCs增殖，参与气道重构[26]。有研究表明，哮喘患者气道平滑肌束中肥大细胞浸润程度明显高于嗜酸粒细胞性支气管炎患者及正常人群[27]。哮喘患者的ASMCs大量分泌CXC趋化因子配体10，其可与肥大细胞中趋化因子受体3结合，从而定向驱使肥大细胞进入气道，随后肥大细胞脱颗粒，分泌类胰蛋白酶、白三烯和前列腺素，进一步促进ECM沉积，并激活ASMCs的增殖[26,28-29]。哮喘的严重程度与ASMCs增殖以及T细胞浸润明显相关，T细胞通过血管细胞黏附分子-1附着于ASMCs上，并与ASMCs直接接触促进ASMCs增殖[30]。

2.2酶和ECM 类胰蛋白酶是丝氨酸家族蛋白酶类，在肥大细胞和嗜碱粒细胞中选择性表达。体外研究表明，类胰蛋白酶是犬ASMCs的促生长因子，可以浓度依赖性方式促进人ASMCs中DNA的合成。另有研究表明，高浓度类胰蛋白酶促进ASMCs增殖的效应高于凝血级联蛋白酶及其他肥大细胞蛋白酶类(如凝血酶、凝血酶因子Xa和糜蛋白酶等)所诱导的ASMCs增殖效应[29,31]。肥大细胞产生的类胰蛋白酶可激活ASMCs中蛋白酶激活受体-2的表达，哮喘患者ASMCs中蛋白酶激活受体-2表达水平的升高，进一步促进了ASMCs的增殖[32]。ASMCs还生成非活性基质金属蛋白酶-1，可被激活的肥大细胞类胰蛋白酶水解而活化，从而促进ECM沉积，使ASMCs生长速率增加约1.5倍。哮喘患者气道中的非活性基质金属蛋白酶-1较无肺疾病人群高5.4倍，且活性基质金属蛋白酶-1的数量与哮喘恶化程度密切相关[33]。

ECM由胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、蛋白多糖、糖胺聚糖、弹性蛋白和细胞黏合素等大分子组成，形成复杂的动态网络，其中胶原蛋白可明显促进ASMCs增殖，增加S期细胞的数量，提高ASMCs的迁移和黏附能力[34]。基质力学的改变也可使ASMCs的增殖发生变化，在具有受控弹性模量的胶原缀合的聚丙烯酰胺水凝胶上培养ASMCs发现，若培养凝胶较平均气道组织硬度低，则可显著增加ASMCs中血管内皮生长因子的分泌；若培养凝胶较平均气道组织硬度高，则能促进细胞增殖，同时减少血管内皮生长因子分泌和激动剂诱导的钙反应[35]。

2.3miRNA miRNA是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，通过与目标信使RNA分子结合，促进信使RNA降解，参与转录后基因的表达调控。有研究证明，miRNA既参与调控ASMCs的炎症反应，又可调控ASMCs的收缩功能，还能调控ASMCs的生长与增殖[36]。体外研究证明，经胎牛血清和转化生长因子刺激后，严重哮喘患者ASMCs的miR-221表达水平明显上调，通过miR-221模拟物上调miR-221水平，促进ASMCs增殖；其抑制剂下调miR-221水平，抑制严重哮喘患者ASMCs的过度增殖[22]。

体外研究表明，miR-590-5p能调控多种细胞的增殖，过表达miR-590-5p可抑制ASMCs增殖[37]。另有研究发现，miR-10a是人原代ASMCs中表达最丰富的miRNA，占所有小RNA分子总量的20%，miR-10a的过度表达可以减少丝裂原诱导的人ASMCs增殖，抑制miR-10a的表达则可明显增加ASMCs增殖[36]。miR-203可负性调控ASMCs增殖，过表达miR-203抑制PDGF诱导的细胞增殖，减少哮喘患者ASMCs中miR-203的表达，抑制ASMCs的增殖[38]。

2.4其他 气道长时间暴露于香烟烟雾中会诱发气道重构并导致哮喘恶化。小鼠长时间暴露于香烟烟雾可造成气道平滑肌层增厚并纤维化，且香烟提取物能促进ASMCs增殖，减少ASMCs凋亡，增加ECM沉积，这种现象可能与线粒体形态(分裂/融合平衡)和功能的改变以及MAPK通路相关[39-41]。有研究报道，香烟烟雾的主要致瘾成分尼古丁在体外呈时间依赖性地诱导大鼠ASMCs的DNA合成，增加ASMCs数量，并通过蛋白激酶B通路诱导细胞周期蛋白D1的表达[42]。

约80%的儿童哮喘患者和超过50%的成人哮喘患者具有免疫球蛋白E依赖性，免疫球蛋白E可加重气道重构，但具体分子机制尚不清楚。免疫球蛋白E致敏可延长炎症细胞的存活时间并增加炎症介质释放，人源ASMCs同时表达低亲和性Fc段受体Ⅱ/CD23和高亲和性Fc段受体Ⅰ免疫球蛋白E受体，且免疫球蛋白E还可调节人源ASMCs的收缩和合成功能[43]。此外，有研究表明，免疫球蛋白E呈浓度依赖性地诱导人源ASMCs增殖，促进DNA合成，并增加ASMCs中ECM和胶原的沉积[44-45]。

长链非编码RNAs可以通过与DNA、RNA和蛋白质的相互作用来发挥多种生物学活性。脑细胞质RNA1是有200个碱基的长链非编码RNA，具有翻译调节功能。有研究发现，不同来源的原代ASMCs中，脑细胞质RNA1的调节活性差异明显，哮喘模型大鼠ASMCs中脑细胞质RNA1的表达水平明显高于健康大鼠，上调脑细胞质RNA1的表达可显著增强哮喘大鼠ASMCs的增殖和迁移；此外，还发现经PDGF-BB处理的ASMCs亦可表达更高水平的脑细胞质RNA1[46]。来自哮喘患者的嗜酸粒细胞与ASMCs共培养可增加ASMCs中Wnt5a、转化生长因子-β1、胶原蛋白和纤连蛋白的表达，进而促进ASMCs的增殖[47]。

3 与ASMCs增殖相关的机制及信号通路

3.1Ca2+通道途径 Ca2+作为细胞内重要的第二信使能调节多种细胞活动，如细胞收缩、分泌、代谢、增殖和分化等。正常细胞内外Ca2+呈动态平衡状态，其稳态是维持细胞正常活动的前提，Ca2+的运输机制对维持细胞内外Ca2+稳态至关重要。在稳态条件下，细胞内Ca2+维持低浓度(100 nmol/L)，细胞外Ca2+维持高浓度(1 mmol/L)[48]。当细胞内Ca2+增加时，Ca2+稳态发生改变，哮喘患者ASMCs发生增殖[49]。哮喘严重时，过多Ca2+进入细胞导致过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助活化因子1α、核呼吸因子-1和线粒体转录因子A的激活以及线粒体生物合成增加，造成ASMCs增殖。而哮喘患者内皮细胞和上皮细胞并不出现细胞异常增殖以及线粒体合成的增加，具有明显的平滑肌细胞特异性[50]。细胞内Ca2+稳态主要通过肌质网Ca2+ATP酶催化ATP水解并将细胞质中游离的Ca2+转运到肌质网来实现。研究显示，中重度哮喘患者ASMCs的肌质网Ca2+ATP酶2表达明显降低；健康人群ASMCs敲减肌质网Ca2+ATP酶2后，ASMCs增殖明显加快[51]。刺激ASMCs后，CD38激活，环腺苷二磷酸核糖触发1,4,5-三磷酸肌醇或激活兰尼碱受体引发Ca2+从肌质网释放至细胞质，导致细胞内Ca2+浓度升高。香烟提取物呈浓度依赖地增加ASMCs内Ca2+相关蛋白色氨酸相关蛋白3、CD38、基质交感分子1等的表达，并与ASMCs的增殖密切相关[52]。Ca2+内流可以通过瞬时感受器香草酸受体电位通道4产生Ca2+微域，称为“瞬时感受器香草酸受体电位通道4 Ca2+火花”。瞬时感受器香草酸受体电位通道4与ASMCs中的Ca2+/钙调蛋白依赖性钙调磷酸酶共定位，激活钙调磷酸酶并使细胞质中活化T细胞核因子去磷酸化，以激活核转位和合成转录途径，从而诱导ASMCs增殖[53]。

瞬时受体电位阳离子通道亚家族M成员7是一种非选择性阳离子通道，其C端具有独特的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域，允许各种二价阳离子(如Ca2+、Mg2+)通过，在多数细胞的存活和增殖等生理过程中具有重要作用。与正常大鼠相比，暴露于烟雾中的大鼠的瞬时受体电位阳离子通道亚家族M成员7表达明显升高，香烟提取物或肿瘤坏死因子-α可明显增加来自烟雾暴露大鼠ASMCs的细胞数；但瞬时受体电位阳离子通道亚家族M成员7沉默可减少香烟提取物刺激的ASMCs增殖[54]。

3.2MAPK途径 MAPK可以调节包括ASMCs增殖在内的多种细胞生理功能，对气道重构起重要作用。ASMCs受到生长因子刺激后，RAF原癌基因丝氨酸/苏氨酸激酶-1磷酸化促分裂原活化的蛋白激酶激酶1/2可激活ERK1/2，继而磷酸化多种下游蛋白激酶、转录因子和其他蛋白，共同促进ASMCs增殖。极样激酶1是参与细胞周期相关过程的一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。有研究表明，PDGF可上调人ASMCs中极样激酶1的磷酸化水平，而敲除极样激酶1后，PDGF所诱导的促分裂原活化的蛋白激酶激酶1/2和ERK1/2的磷酸化水平明显降低，ASMCs增殖明显下降[55]。血管内皮生长因子亦可通过促分裂原活化的蛋白激酶激酶1/2通路诱导ASMCs增殖，而维生素D3亦是通过抑制ERK1/2的磷酸化进程来抑制血管内皮生长因子诱导的增殖[23]。维生素D缺乏与哮喘严重程度密切相关[56]。维生素D主要通过抑制ERK1/2通路和下调解整合素金属蛋白酶33和基质金属蛋白酶-9的表达来抑制ASMCs的生长并对抗气道重构[23,57-58]。另有研究发现，小分子褐藻糖胶通过抑制PDGF诱导的蛋白激酶B、ERK1/2和核因子κB的磷酸化来调控细胞的G1/G0周期，从而抑制ASMCs的增殖[59]。

3.3氧化应激途径 细胞内活性氧类主要由线粒体产生。活性氧类作为第二信使参与调节细胞内多种分子途径，并可促进多种细胞的增殖，在ASMCs病理性增殖中具有重要作用[60]。许多因素可使ASMCs中活性氧类的含量升高，如香烟提取物可明显促进ASMCs增殖，并可在ASMCs内检测到高水平的活性氧类[52]。NADPH氧化酶4是人ASMCs 中主要的NADPH氧化酶，转化生长因子-β1通过调控NADPH氧化酶4的表达提高细胞中活性氧类的水平，从而促进ASMCs的增殖，可见，转化生长因子-β1诱导ASMCs增殖也与活性氧类密切相关[61]。此外，PDGF-BB对ASMCs增殖的作用也与活性氧类水平密切相关[62]。研究发现，S100钙结合蛋白A9可明显抑制ASMCs增殖，降低细胞内S100钙结合蛋白A9的表达可显著促进PDGF诱导的大鼠ASMCs增殖，并增加细胞内活性氧类水平[63]。

4 小 结

气道重构是哮喘(尤其是中重度哮喘和致命性哮喘)的重要病理特征，可导致不可逆性气道阻塞以及气道高反应性的持续恶化。ASMCs是最基本的气道结构细胞，可通过收缩或舒张气道调节气流。ASMCs作为气道内的主要效应细胞，被诱导激活后发生过度增殖，在气道重构中起重要作用，明确影响ASMCs增殖的因素及相关分子机制对哮喘的防治具有重要意义。对ASMCs研究的不断深入以及调控ASMCs增殖新靶标的发现将为哮喘防治提供新的思路和研究方向。