猪圆环病毒2型感染对猪小肠上皮细胞Claudin-1蛋白和闭锁小带蛋白-1基因mRNA表达的影响

杨昕坦，阮 峥，李焕荣

(北京农学院动物科学技术学院，北京 102206)

猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2，PCV2)感染引起的肠炎可威胁断奶仔猪生长，肠炎过程伴随肠黏膜屏障功能损伤[1]和小肠黏膜免疫系统功能的下降。小肠肠道黏膜屏障可防止致病性物质的侵入和阻止肠道内细菌及内毒素的移位[2]，对保护机体肠道健康具有重要的作用。肠道黏膜上皮的完整性及正常的再生能力是肠黏膜屏障的结构基础，肠黏膜屏障功能的损害可引起通透性增高，诱发炎症反应[3]。紧密连接在肠壁通透性、阻止内毒素和毒性大分子物质进入体内发挥着尤为重要的作用[4]。Claudins等4种跨膜蛋白与连接复合物蛋白、细胞骨架结构共同构成紧密连接复合物[5]，Claudin-1蛋白(Claudin-1)和闭锁小带蛋白-1(ZO-1)在细胞紧密连接蛋白的表达和合成中发挥重大作用[6]。

IPEC-J2细胞系(Intestinal porcine epithelial cell line)具有完整的上皮细胞特征，PCV2可感染IPEC-J2并增殖[7]。本研究基于荧光定量PCR方法，通过基因克隆构建Claudin-1和ZO-1重组质粒的标准曲线，探索PCV2感染的IPEC紧密连接蛋白的mRNA动态变化，为PCV2感染损伤肠黏膜屏障的机制提供试验数据。

1 材料与方法

1.1 毒株、细胞及主要试剂

PCV2 SD/2008株：第3代(TCID50为105.25/mL)；猪小肠上皮细胞系(IPEC-J2.ACC701，DSMZ)中国农业大学惠赠；TRIzol LS Reagent购自Invitrogen；HiFi-MMLV cDNA第一链合成试剂盒、DNA快速胶回收试剂盒、高纯度质粒小提中量试剂盒等均购自北京博尔优公司。

1.2 方法

1.2.1 PCV2感染猪小肠上皮细胞病毒载量的测定 参考文献方法[8]，将处于对数生长期的IPEC接种于6孔板中，每孔细胞数为3×105个，用10%DMEM培养基培养至细胞达60%，感染组以MOI=0.1感染PCV2毒株。分别于感染后4、12、24、48、72 h收集相应的小肠上皮细胞。每个时相设3个重复。用实验室建立的PCV2实时荧光定量PCR检测IPEC中PCV2核酸载量变化。

1.2.2 Claudin-1和ZO-1重组质粒的构建 参考文献方法[9]，由上海生物工程公司合成Claudin-1和ZO-1目的基因的引物。研究所用引物序列和反应条件如表1所示。

用Claudin-1和ZO-1特异性引物对IPEC的cDNA进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳观察，回收纯化PCR产物，克隆目的片段，构建重组质粒进行PCR验证、测序比对及OD值的测定。

表1 Claudin-1、ZO-1、PCV2及看家基因Real-time FQ PCR的引物和PCR条件Tab.1 Real-time FQ-PCR primersand condition of Claudin-1, ZO-1, PCV2 and β-actin

1.2.3 Claudin-1、ZO-1 mRNA荧光定量PCR方法的建立 将Claudin-1和ZO-1重组质粒10倍系列稀释为108～103copies/μL，进行SYBR Green I 荧光定量PCR扩增，建立Claudin-1和ZO-1的标准曲线。参考文献方法[9]，反应条件稍加改动：95℃ 10 min(预变性)，95℃ 30 s，55℃/51℃，30 s(退火)，72℃ 30 s，40个循环，50～95℃进行读板。

1.2.4 PCV2感染的IPEC中Claudin-1和ZO-1 mRNA的检测 收集感染4、12、24、48、72 h的IPEC，每个时相3个重复。按TRIzol LS Reagent 说明书提取RNA，并进行反转录，用建立的荧光定量PCR检测Claudin-1和ZO-1 mRNA的动态变化。

1.3 数据处理与统计分析

经Real-time FQ-PCR反应后，获得每个样品中Claudin-1、ZO-1基因及看家基因β-actin的拷贝数。将Claudin-1、ZO-1 cDNA拷贝数除以同一样品中看家基因β-actin的cDNA拷贝数，得到Claudin-1、ZO-1基因与看家基因的一个倍比值，用于表示感染组Claudin-1、ZO-1 mRNA水平的动态变化。采用独立样本t检验法，分析感染组与对照组各个时相IPEC中Claudin-1和ZO-1 mRNA表达量，并进行差异显著性分析。P<0.05为差异显著，在图中用*表示；P<0.01为差异极显著，图中用**表示差异。

2 结果与分析

2.1 PCV2感染猪小肠上皮细胞病毒载量的动态变化

PCV2感染IPEC后，用Real-time FQ PCR检测5个时相IPEC中PCV2的核酸含量。感染后4 h即可在IPEC中检测到病毒核酸，48 h时病毒含量达到最高，至72 h时病毒核酸载量曲线呈下降趋势，表明PCV2可在IPEC中72 h内持续存在，且可增殖(图1)。

2.2 Claudin-1和ZO-1标准曲线的建立

质粒PCR扩增结果分别可见唯一的特异性目的片段，测序结果经比对显示与参考序列100%相同，OD260/280值为1.97和1.94(1.8～2.0)，表明Claudin-1和ZO-1基因片段的重组质粒构建成功，可用于标准曲线的建立。对重组质粒进行稀释并进行荧光定量PCR扩增，扩增曲线显示，Claudin-1和ZO-1相同浓度梯度质粒的扩增曲线基本重合，相邻浓度梯度质粒曲线的间距均匀(图2A)；溶解曲线(图2B和2C)显示，所有产物具单一整齐的峰。两基因标准曲线线性关系均良好(图2D)，可用于后续研究。

图1 PCV2接种后不同时间IPEC中病毒核酸动态Fig.1 Dynamics of viral nucleic acid in IPEC at different time after inoculated with PCV2

图2 Claudin-1和ZO-1荧光定量标准曲线Fig.2 The standard curves of fluorescence quantitative RT-PCR of Claudin-1 and ZO-1

2.3 Claudin-1和ZO-1 mRNA表达的动态变化

荧光定量RT-PCR检测和数据分析结果显示，Claudin-1和ZO-1 mRNA表达变化如图3。Claudin-1和ZO-1 mRNA的转录水平在4、12、24、48、72 h这五个时相内全部下降，且ZO-1 mRNA表达差异均极显著，12、48和72 h三个时相Claudin-1 mRNA表达极显著下降，表明PCV2感染可抑制Claudin-1和ZO-1 mRNA表达。

图3 PCV2感染后IPEC中claudin-1与ZO-1 mRNA 表达变化Fig.3 Changes of Claudin-1 and ZO-1 mRNA expression in IPEC after infected with PCV2

3 讨 论

PCV2可感染IPEC并在其中增殖。病毒的感染可显著下调IPEC紧密连接蛋白Claudin-1和ZO-1 mRNA的表达，提示PCV2感染可以抑制猪小肠上皮细胞紧密连接蛋白相关基因的表达，破坏细胞间的紧密连接，增加肠道通透性。

有报道[5]，PCV2感染IPEC，病毒载量从6 h开始呈现逐渐上升趋势，在96 h时达顶峰，之后下降。本研究结果显示，病毒载量从4 h上升至48 h达到峰值，之后呈下降趋势。尽管趋势有差异，但也说明PCV2可在IPEC中增殖。

肠道黏膜上皮的完整性及正常的再生能力是肠黏膜屏障的结构基础。紧密连接受损，肠上皮细胞间隙通透性增加，细菌或毒素借此进入体循环，引起肠道感染[6]。基因芯片结果显示PCV2感染可引起Claudin等相关紧密连接蛋白表达的下降，提示PCV2感染可增强小肠肠壁通透性，黏膜组织屏障功能降低，便于毒性大分子和微生物通过，降低了机体的防御能力，为PCV2感染机体提供便利条件[11]。

Claudin对维持和调节紧密连接屏障功能有重要作用[12, 13]，Claudin蛋白之间链锁连接形成的细胞旁路途径是影响紧密连接通透性的主要因素，炎症性肠病(IBS)就是肠上皮细胞旁路通透性增高[14]。Claudin 24种异构体中除Claudin-2、5、6表达增加能降低肠壁屏障功能外，其他Claudin蛋白的缺失能增加肠壁的通透性[15]。本研究发现PCV2感染的IPEC表达Claudin1能力降低，提示PCV2可增加肠道上皮的通透性，进而影响肠道黏膜屏障。紧密连接蛋白1(ZO-1)是组成紧密连接的蛋白，广泛存在于脊椎动物的紧密连接中[16, 17]。大多数Claudin蛋白通过羧基端与ZO-1、ZO-2、ZO-3的C端连接构成连接复合体，ZO-1从连接复合体移位会导致肠黏膜紧密连接松弛[18]。肌动蛋白丝将连接复合体与肌动蛋白环相连，通过收缩可以调节肠壁的通透性[19]。细菌侵袭、细胞因子及炎性介质的刺激均可导致Claudin和ZO-1表达的下降，影响紧密连接的结构，导致肠壁通透性的增加，引起细菌的移位及炎症反应等[9]。肠黏膜受到损伤分泌的TNF-α、INF-γ等炎性细胞因子作用于细胞间的紧密连接结构，降低紧密连接蛋白ZO-1的表达，导致紧密连接的瓦解，破坏肠道屏障，增强黏膜通透性[20]。本研究显示PCV2感染不仅降低Claudin-1表达，同时也降低ZO-1表达，而有报道感染的细胞微丝骨架呈现聚合现象，应力纤维减少，细胞界限明显[7]，可见多重因素同时影响IPEC结构完整性，导致肠道黏膜损伤。