白花蛇舌草水提物通过抑制MAPK通路致肺癌细胞的凋亡

郭洪梅，赵 丹，曹 琳，夏 辉

徐州市第一人民医院 药学部，徐州221000

肺癌是发病率和死亡率增长最快、对人类健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一[1]。近50年来许多国家报道肺癌的发病率和死亡率均明显增高，男性肺癌发病率和死亡率均占所有恶性肿瘤的第一位，女性发病率占恶性肿瘤的第二位，死亡率占第二位[2，3]。当前肺癌的治疗主要是化学疗法和分子靶向治疗。化疗主要用一些破坏DNA结构和功能的药物，如顺铂、奥沙利铂[4]；影响微管合成的药物长春碱、紫杉醇等[5]。近年来兴起的小分子靶向药物如表皮生长因子（EGFR）酪氨酸激酶抑制剂（TKs）[6]等。尽管如此，这些药物的疗效十分有限，临床上对于病人生存期及生活质量改善并不尽如人意，肺癌的治疗现状仍然堪忧。相比而言，中医药由于其成分复杂，往往具有多靶点、多重功效且副作用小的特征而越来越被人们重视[7]。目前已有多种中草药被作为主要或辅助药物用于肺癌的治疗[8]。

白花蛇舌草为茜草科耳草属植物白花蛇舌草（Hedyotis diffusa Willd）的干燥全草，又名蛇舌草、蛇利草、蛇总管、二叶葎等[9]。白花蛇舌草主要分布于浙江、江西、福建、湖北、广东及西南等地，具有清热解毒、活血化瘀、利湿通淋等作用，常用于治疗肿瘤、黄疸型肝炎、胃肠炎、肺炎等疾病[10]。白花蛇舌草具有明显的抗肿瘤活性，临床上经常用于治疗各种癌症，如胃癌、直肠癌、恶性淋巴瘤、子宫颈癌、卵巢癌、膀胱癌等消化道、生殖系统、淋巴系统的癌症[11]。

目前，对于白花蛇舌草抗肿瘤物质基础及作用机制的研究已取得了一些成绩，但是白花蛇舌草抗肺癌的疗效和分子机制尚不明确，严重制约着白花蛇舌草的临床应用[12]。因此有必要对白花蛇舌草抑制肺癌的作用机制进行深入、系统的研究，为白花蛇舌草开发成肺癌治疗药物提供理论基础。本研究通过体内体外研究深入探讨了白花蛇舌草（BHSSC）水提物的抗肿瘤疗效及其机制，发现了其促进肿瘤细胞凋亡的关键信号通路，将为阐明白花蛇舌草的抗肺癌机理提供理论依据。

1 实验材料

1.1 细胞株

人肺癌细胞株A549和PC-9细胞，购于上海中科院细胞库；7-氨基放线菌素D（7-AAD，美国BD公司）。

1.2 动物

全雌性BALB/c（Nu/Nu）裸鼠，常州卡文斯实验动物有限公司，许可证号：201810896。

1.3 药品与试剂

肺癌治疗阳性药顺铂（CDDP，美国MCE公司，No：HY-17394），溶于二甲亚砜（DMSO）中制成浓度为20 mmol·L-1的储备液，贮存于-20℃冰箱，稀释后用于实验；MTT（美国Sigma公司）；RMPI-1640培养基粉末、DMEM培养基粉末、胰酶（0.25%Trypsin-EDTA）、胎牛血清、青霉素加链霉素（美国Gibco公司）；PE Annexin V凋亡检测试剂盒（美国BD Pharmingen公 司，Lot：7026588）；Erk、p-Erk、JNK、p-JNK、p38、p-p38抗体（美国CST公司）；EDTA（乙二胺四乙酸，国药集团）。

2 实验方法

2.1 白花蛇舌草（BHSSC）水提物的制备

白花蛇舌草30 g加入10倍量沸水提取3次，每次1 h，提取液经纱布过滤后混合，旋转蒸发浓缩至100 mL，0.22μmol·L-1过滤除菌后置于4℃保存，用于后续实验研究。用药剂量按实验动物与成人体表面积比等效量核算比率，计算动物的等效剂量。实验时以去离子水配制成所需浓度，放4℃冰箱保存。

2.2 MTT法检测BHSSC水提物对肺癌细胞的增殖活力的影响

MTT法用于检测不同候选药物对2种肺癌细胞株A549、PC-9细胞的增殖抑制作用。取对数生长期的细胞以每孔5×103个的密度接种于96孔板中。BHSSC水提物按照预设的药物浓度加药（0、50、100、200、300、400、500、600μg·mL-1），各组设置3个复孔，于37℃培养箱中培养48 h。200μg·mL-1BHSSC水提物处理A549、PC-9细胞不同时间（0、6、12、24、48、72和96h），药物处理时间结束后，每孔加入浓度为5g·L-1的MTT 10μL，37℃培养箱孵育4 h后，吸取上清液，每孔加入DMSO 100μL于振荡器上溶解10 min，测定A570nm/A630nm值并计算增殖抑制率。 增殖抑制率 （%）=（Atest570nm-Atest630nm）/（AControl570nm-AControl630nm）×100%。

2.3 流式细胞术检测BHSSC水提物诱导肺癌细胞凋亡

取对数生长期的肺癌细胞株A549、PC-9细胞，以1×105个/mL的密度种入6孔板后于37℃、5%CO2细胞培养箱中常规培养过夜，待细胞长到80%融合度后分别加入不同浓度的BHSSC水提物（0、200、400μg·mL-1）处理48 h。到达时间点后用不含EDTA的胰酶消化收集细胞，用PBS洗涤细胞2次（2 000 r·min-1离心5 min），收集1×105个细胞；加入结合缓冲液悬浮细胞100μL；加入Annexin V-PE（PE标记的膜磷脂结合蛋白V，美国BD公司）5μL混匀后，加入7-AAD 5μL，混匀。室温、避光、反应15 min后，用流式细胞仪检测（GUAVA Easy Cyte，Millipore，US）肺癌细胞凋亡效果。

2.4 Western blot法检测BHSSC水提物对肺癌细胞中MAPK信号通路的影响

取对数生长期的肺癌细胞株A549和PC-9细胞，以2×105个/mL的密度种入6孔板后于37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养过夜，待细胞长到80%融合度后分别加入不同浓度的BHSSC水提物（0、100、200、400μg·mL-1）处理48 h，并以20μmol CDDP作为阳性对照。在冰上用裂解缓冲液RIPA裂解细胞30 min，提取全蛋白，加入上样缓冲液，用煮样器煮沸3min后，上样用SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，再以100V转膜1h，用5%脱脂牛奶封闭2 h后，孵育一抗（1∶1000稀释）于4℃孵育过夜，用TBST（含0.1%吐温-20）漂洗4遍（间隔10 min）后，二抗（1∶10 000稀释）孵育1 h，经TBST漂洗4遍后于ECL曝光显影，曝光Erk、p-Erk、JNK、p-JNK、p38、p-p38等目的条带，用Image J软件对曝光的条带的相对灰度值进行计算并统计。

2.5 裸鼠移植瘤模型检测BHSSC水提物对体内肺癌生长的抑制活性

全雌性BALB/c（Nu/Nu）裸鼠，3~4周龄，体重（14±2）g，适应饲养一周后，根据体重平均分为模型组、BHSSC给药组（10 mg·kg-1）和阳性药顺铂组（1 mg·kg-1）三个组，每组7只动物；取生长良好的A549细胞使用预冷PBS洗涤后消化，再用预冷PBS洗涤两次后计数，调整细胞浓度与基质胶1∶1混合成浓度为2×107/mL的细胞悬液，放置于冰上备用；采用皮下注射方法，以0.2 mL/只的量接种于裸鼠右前肢腋下；造模3天后，腹腔注射给药，每两天记录裸鼠体重、瘤体积（瘤体积按V=0.5×a×b2公式计算，其中a为肿瘤长径，b为肿瘤短径）；给药21天后处死小鼠，终止实验。

3 结 果

3.1 MTT法检测BHSSC水提物对肺癌细胞增殖的影响

为了验证候选BHSSC对肺癌细胞增殖的影响，本实验采用MTT法检测不同BHSSC水提物对肺癌细胞A549、PC-9的增殖抑制作用。作用48 h后，结果如图1A所示，BHSSC水提物对肺癌细胞有显著的剂量依赖的增殖抑制作用，当浓度达到600 μg·mL-1时抑制率超过95%，对A549细胞的IC50为287μg·mL-1，PC-9细胞的IC50为326μg·mL-1。并且随着作用时间的延长，BHSSC水提物的作用越显著（图1B）。给药浓度达到400μg·mL-1时，A549细胞和PC-9细胞发生明显皱缩变圆（图1C）。

图1 白花蛇舌草对肺癌细胞株A549和PC-9细胞的增殖抑制活性。

3.2 流式细胞术检测BHSSC水提物对肺癌细胞凋亡的影响

本实验通过流式细胞术检测BHSSC水提物诱导肺癌细胞凋亡活性。如图2所示，不同浓度BHSSC水提物处理A549细胞和PC-9细胞48 h后，PE+/7-AAD细胞增多，即细胞开始发生凋亡。综合分析发现，BHSSC水提物能剂量依赖性促进两种肺癌细胞的凋亡。

3.3 荷瘤裸鼠模型检测BHSSC水提物体内抗肺癌活性

如图3所示，通过荷瘤裸鼠实验，发现BHSSC水提物有显著的延缓肿瘤生长活性，与模型对照组相比，差异显著（P<0.01）。并且BHSSC水提物对小鼠体重几乎没有影响（P>0.05），提示其毒副作用较弱。

3.4 BHSSC水提物对MAPK通路的影响

如图4所示，BHSSC水提物能够显著降低A549细胞MAPK通路中关键蛋白Erk、p38、Junk的表达和磷酸化水平，从而抑制MAPK通路的活化，最终诱导肺癌细胞凋亡，并且400μg·mL-1的凋亡诱导效果与20μmol CDDP的效果相当。

4 讨 论

中药抗肿瘤以其具有多靶点、多重功效显著、毒副作用小等特点日益受到国内外学者的重视。白花蛇舌草是我国传统中药，是临床治疗肿瘤的有效药物。近年来开展了大量的临床和基础研究工作来揭示其抗肿瘤机制和物质基础。但是白花蛇舌草对肺癌的治疗效果尚缺乏足够的临床数据支撑，且其对肺癌的抗肿瘤活性目前也大多处于实验研究阶段，抑制肺癌的分子机制尚未明确。

促分裂素原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAP激酶，MAPK）链是真核生物信号传递网络中的重要途径之一，在基因表达调控和细胞质功能活动中发挥关键作用[13]。MAPK有4个主要亚族：ERK、JNK、p38MAPK和ERK5。MAPK可促进血管内皮细胞增殖和新血管生成[14]。新血管生成后可为肿瘤提供更多的营养，加速肿瘤的生长，促进癌细胞的扩散。MAPK通路的异常活化与肿瘤的增殖、转移和侵袭密切相关。因此MAPK通路可作为抗肿瘤靶点而被广泛研究。本研究发现，白花蛇舌草水提物对两种肺癌细胞有一定的杀伤作用。当药物达到一定浓度时，BHSSC水提物对肺癌细胞有显著的剂量依赖的增殖抑制作用。当浓度达到600μg·mL-1时抑制率超过95%，对A549细胞的IC50为287μg·mL-1，PC-9细胞的IC50为326μg·mL-1；并且随着作用时间的延长，BHSSC水提物的抑制作用越显著。通过荷瘤小鼠实验发现，BHSSC水提物也具有显著的体内抗肺癌活性，给药22天后，肿瘤生长抑制率达到65%。此外连续给药对动物体重无显著影响，提示BHSSC水提物的毒副作用较弱。进一步探索发现，白花蛇舌草水提物能显著抑制MAPK通路中关键分子ERK、jnk、p38的磷酸化表达，从而促进肺癌细胞凋亡及抑制肿瘤的生长和侵袭。

本研究可为阐明白花蛇舌草抑制肺癌的分子机理提供理论参考，并且为白花蛇舌草研发成具有中医药特色的肺癌治疗药物提供依据。

图2 白花蛇舌草处理后引起肺癌细胞株A549和PC-9细胞凋亡

图3 白花蛇舌草体内抗肿瘤活性

图4 白花蛇舌草对细胞凋亡相关MAPK通路关键蛋白表达及磷酸化的影响