上皮间质转化与肿瘤微环境对肿瘤细胞转移机制的研究进展

曾志华,鲁雄兵

(南昌大学第二附属医院泌尿外科,江西南昌 330006)

上皮间质转化(epitheliai-mesenchyma transition,EMT)是由众多调节因子经过各种调节通路导致上皮细胞特性消失而表达间充质细胞特性的细胞转化过程。EMT的典型特征是上皮细胞标记物下调，如E-钙黏蛋白(E-cadherin)、紧密连接(ZO1)、桥粒(desmoplakin)、细胞角蛋白(cytokeratins)、层黏连蛋白(laminin)，同时伴随间质标记物表达的升高，如N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(vimentin)、β-连环蛋白(β-catenin)、细胞骨架重组，特别是E-钙黏蛋白的下调及N-钙黏蛋白的上调是EMT的标志性特征[1]。EMT是一个动态的连续的过程，由于EMT过程导致E-钙黏蛋白、细胞角蛋白、桥粒等下调及N-钙黏蛋白、波形蛋白等的表达上调而造成细胞间的紧密连接、缝隙连接破坏，引起上皮细胞间结构松散，同时引起圆形或方形的上皮细胞重塑成梭形间质细胞形态，获得运动能力，具备侵袭性。

EMT可分成3型：Ⅰ型与胚胎生长发育密切相关，在早期胚胎发育时中胚层形成、神经嵴发育、心脏瓣膜发育、次生腭的形成以及男性苗勒管退化，胚胎细胞经过反复的EMT及间质上皮转化(mesenchyma-epitheliai transition,MET)过程完成器官组织生长发育；Ⅱ型与组织创伤的修复愈合纤维化密切相关，在组织的创伤及创伤后炎症期都能够引发上皮细胞EMT过程促使组织修复或纤维化[2]；Ⅲ型EMT与肿瘤的生长、侵袭、转移、耐药、肿瘤干细胞形成等相关，EMT主要是通过改变转录因子调控的基因表达，而进一步改变细胞表型。EMT诱导转录因子一般含有：Snail家族(Snail1、Snail2)、ZEB家族(ZEB1、ZEB2)、螺旋-环-螺旋家族(TWIST1、TWIST2、TCF3)，此外还有PRRX1、YAP1/TAZ、SOX4、miRNAs等[3]。诱导EMT过程与肿瘤细胞所处的微环境密切相关，而且是肿瘤细胞与非肿瘤细胞共同作用的结果，细胞外多种因素刺激相应信号通路，产生相应的诱导转录因子，进而产生相关的基因表型。

1 EMT与肿瘤生长微环境

近年来EMT的研究为肿瘤的研究开辟了新的途径，使得对肿瘤的发生发展有了新的认识。下面将从EMT与肿瘤生长微环境之间的相互关系进行阐述。

1.1 EMT与炎性肿瘤微环境大多数人类实体肿瘤起源于全身各处上皮细胞。肿瘤与长期慢性炎症刺激密切相关，并且炎性肿瘤微环境有助于肿瘤向恶性改变。肿瘤细胞EMT的发生依赖于微环境细胞因子及趋化因子参与，在突变最频繁的肿瘤细胞中发现RAS基因蛋白，可诱导肿瘤细胞高表达细胞因子及趋化因子，而这种炎性微环境可诱导激活多种途径促进肿瘤发展，包括EMT过程[4-5]。还有研究发现白介素(interleukiu,IL)-10、IL-6、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF-α)、IL-1β等细胞因子也可以促进EMT，这些炎症因子主要是通过核转录因子(nuclear factor,NF)-κB信号通路激活EMT[6-7]。近期的一项研究表明EMT过程可以引起IL-6的高表达，而IL-6具有协同促进EMT整个过程的作用[8]。IL-6的高表达给多类致癌因素创造合适的环境，从而促进肿瘤细胞的发生、存活、增殖，在多发性骨髓瘤、非小细胞肺癌、结直肠癌、肾细胞癌、前列腺癌、乳腺癌和卵巢癌肿瘤微环境中证实IL-6显著升高[9]。此外肿瘤微环境中的炎症相关细胞(巨噬细胞、嗜中性粒细胞和髓源性抑制细胞)同样参与肿瘤进展。有研究证实在肺癌、乳腺癌、前列腺癌和卵巢癌中肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages,TAMs)与肿瘤预后呈负相关，其机制主要是通过转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)信号途径激活肿瘤细胞EMT过程，并且TAMs还可以维持肿瘤细胞的间质细胞特性[10-11]。EMT过程有利细胞分泌炎症因子，同时炎症因子诱导肿瘤细胞EMT，从而抑制肿瘤细胞凋亡、缩短细胞分裂周期、增强侵袭性。

1.2 EMT与酸性肿瘤微环境有研究表明肿瘤微环境的显著特征就是细胞外酸中毒，酸性微环境有利于肿瘤的生长、转移[12]。由于肿瘤代谢中三羧酸循环被抑制，糖酵解代谢被激活，乳酸产生增多，另一方面肿瘤细胞清除酸的水平较低，这些因素共同造成了实体肿瘤的酸性微环境[13]。越来越多的证据表明，酸性微环境促使肿瘤细胞发生EMT过程，进而增强肿瘤细胞的生长优势和转移优势。酸性微环境抑制miR-652转录，造成转录因子ZEB1的高表达，从而诱导胰腺癌细胞EMT[14]。在一项有关于鼻咽癌体外实验的研究中发现，实体肿瘤的酸性微环境可诱导鼻咽癌5-8F细胞发生EMT，使肿瘤细胞对紫杉醇更加耐受[15]。在另外一项实验中发现得出相似的结论，可明显观察到BRAFV600E黑色素瘤细胞在酸性环境中肿瘤细胞增生活跃、抗凋亡能力增强、对BRAF抑制剂威罗菲尼更加耐受[16]。乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDHA)是糖酵解过程中将丙酮酸转化为乳酸的最后一个酶，LDHA活性增强促使实体肿瘤内乳酸堆积，使细胞外基质发生转化和重构，为肿瘤细胞的生存与转移创造了一个有利的环境[17]。此外，酸性环境可以引起基因突变、染色体异常、基因组不稳定性，与肿瘤细胞耐药也密切相关[18]。在酸性肿瘤微环境中，各种诱导因子诱导肿瘤细胞发生EMT过程，可能并不是简单的经过调整基因的表达而改变代谢途径，而是通过EMT过程改变基因重新编程，克服当前环境的局限，为远处转移以获取更多能源做好准备。由EMT诱导的肿瘤细胞代谢途径的改变，针对性地在新生代谢途径中的代谢酶设计抑制物，在肿瘤发生转移的早期就能抑制肿瘤的生长，为肿瘤的治疗提供了一个思路。

1.3 EMT缺氧肿瘤微环境肿瘤细胞通过无限制的细胞快速分裂实现快速生长，但也造成实体肿瘤内缺氧的微环境，瘤体内缺氧是实体肿瘤的另一大特征。肿瘤的缺氧微环境同样可以促进肿瘤细胞发生EMT，通过改变原有的能量代谢途径、调整基因表型、促进肿瘤血管形成等方式适应及改善缺氧环境。在缺氧的环境下，瘤体内的缺氧诱导因子1(hypoxia inducible factor-1，HIF1)是诱导肿瘤细胞发生EMT的重要机制，HIF1诱导激活PI3K/Akt/mTOR信号通路，以及诱导琥珀酸脱氢酶和延胡索酸水合酶等肿瘤抑制蛋白突变，进而改变原有的代谢途径[19-20]。肿瘤间质成分促进EMT过程，同时也可以促进肿瘤血管形成，以增加供氧。HIF1激活NF-κB、Nocth等信号通路，刺激血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)生成增加，从而促进血管内皮细胞出芽、伸长、塑形等过程，促进血管形成[21]。TAM等[22]阐述缺氧、低pH、低糖等肿瘤微环境诱导EMT过程促使肿瘤细胞产生不同的表型。在1999年，MANIOTIS等[23]在研究人眼葡萄膜恶性黑色素瘤时发现了一种脉管结构，后证实这是具有高侵袭性肿瘤细胞及间质共同构成的一种不同于血管的脉管结构，成为实体肿瘤内功能性循环的重要组成部分，并将该组织命名为血管生成拟态，后研究表明血管生成拟态参与肿瘤细胞转移、肿瘤耐药等过程。在缺氧环境中，HIFs、Twist、CD133、表皮生长因子、泛素特异性蛋白酶等细胞因子通过诱导激活Wnt/β-catenin、VE-cadherin/EphA2/PI3K/MMPs/Laminin-5γ2等信号通路，刺激肿瘤细胞EMT过程进行间质转化，促进肿瘤细胞重塑成血管内皮细胞形态，构成功能性脉管结构，促进血管生成拟态形成[24-25]。

2 EMT与肿瘤转移

肿瘤细胞转移一直被认为是恶性肿瘤的特征，并提示预后不良。肿瘤转移是指恶性肿瘤细胞逃离原发癌，经血管、淋巴管、体腔定植到其他部位的过程，并且具有重新自我增殖、形成新肿瘤的能力。

在目前，EMT-CTCS-MET转移模型是被普遍接受的转移学说，原发肿瘤细胞经过间质改变导致细胞间连接松散，细胞极性消失，细胞形态变成梭形细胞，且该细胞具有侵袭性，肿瘤细胞经阿米巴运动方式，侵入血管、淋巴管，到达目的器官后，经过MET过程，重新恢复到原肿瘤细胞形态，进行自我增殖[26]。肿瘤的缺氧、酸性、炎性微环境都可以诱导肿瘤细胞发生EMT并促进转移。TGF-β通过调控EMT促进肿瘤转移过程中发挥重要作用，TGF-β主要是通过Smad与非Smad通路调控EMT过程。TGF-β与丝氨酸/苏氨酸激酶受体结合使TGFR2磷酸化，进而激活TGFR1，TGFR1将下游的R-Smads磷酸化，从而形成复合物，诱导EMT过程，导致E-钙黏蛋白的下调[27]。在非Smad通路中，TGF-β主要是通过Rho家族、PI3K-Akt、MAPK通路调节EMT，激活Rho等酶后，可诱导肌动蛋白重组及板状伪足及丝状伪足的形成[28]，将Akt抑制、E-钙黏蛋白表达上调，可以逆转EMT过程[29]。EMT还通过其他途径诱导肿瘤细胞转移，MYC基因与Jum结构域结合蛋白-6结合后可促进肿瘤细胞转移[30]；转录因子FOXM1使属于叉头转录因子家族成员，通过下调金属蛋白酶家族MMP2和MMP9的活性，促进多种肿瘤侵袭性和转移特性[31]；另外FOXM1还通过改变肿瘤细胞的代谢途径间接促进肿瘤细胞的转移[32]；miRNA在肿瘤的转移中也扮演重要角色，miR-200f、miR-205、miR-34f等下调可促进锌指蛋白(ZEB1/ZEB2)高表达，进而诱导肿瘤细胞间质转换，促进肿瘤转移[33]。

在EMT-CTCs-MET转移模式提出后，有研究者提出不同的疑问。目前研究EMT与肿瘤转移得到的证据均来自体外实验，在体内的EMT具体过程尚不清楚[34]。在研究肿瘤转移过程的实验中，一般是通过研究间接推断肿瘤转移，而没有直接证据观察到肿瘤细胞的EMT-CTCs-MET整个级联过程，而且EMT过程难以量化、复杂的生物分子参与、具备时间及空间特异性，这些都是对目前肿瘤转移分子模式提出的质疑[35]。在一项有关乳腺癌患者的研究中，在术前未提示转移的乳腺癌患者手术切除1年后出现其他器官转移病灶，临床上具有4%～5%肿瘤患者在未发现原发肿瘤病灶而出现其他部位转移的情况，有些研究者提出转移可能发生在原发肿瘤形成之前[36]。另外，有研究者对EMT利于肿瘤转移提出质疑。在一项研究肺癌转移小鼠模型中发现，追踪被标记已表达EMT标志物的肿瘤细胞(成纤维细胞特异性蛋白-1和波形蛋白被标记)，而在转移瘤中并未发现存在被标记的细胞[37]；在另一项研究中发现，在胰腺导管性腺癌小鼠模型中，特异性减少诱导EMT的关键分子Snai1和Twist1，结果发现并没有对肿瘤转移产生很大影响[38]。就目前研究证据而言，转移机制尚还需进一步研究，尚存在很多争议。

3 EMT、肿瘤微环境及肿瘤细胞转移之间的关系

实体肿瘤的形成受众多因素的影响，长期不良因素的慢性刺激、基因突变、基因表型改变、肿瘤细胞免疫逃逸都可以促使肿瘤细胞的形成，此外肿瘤细胞生长的微环境对肿瘤细胞的形成及存活至关重要。细胞外的炎性、缺氧、酸性环境中的相关细胞因子可促使肿瘤细胞发生间质改变，而这种改变利于肿瘤细胞，发生EMT的细胞将更加具有侵袭性的特点，这种侵袭性是肿瘤细胞转移的基础。在体外实验中，细胞划痕实验提示炎性环境中发生EMT的细胞可促使划痕短时间内愈合；而在体内实验中，上皮细胞肿瘤是不具侵袭性，缺氧及酸性环境中促使上皮肿瘤细胞发生EMT改变，这种改变可使肿瘤细胞向远处转移。EMT、肿瘤微环境及肿瘤细胞转移三者相互作用、相互影响。

4 总 结

基础生物学与转化生物学的飞速发展使我们对肿瘤研究更加深入、更加全面，从而推进抗肿瘤药物的研发。虽然肿瘤细胞存在不同阶段、不同的形态、处在不同的环境中，但是EMT关联肿瘤细胞的侵袭、复发、转移、耐药、CSCs形成、血管生成等各个过程中，则EMT分子机制的研究对肿瘤治疗意义重大。在实体肿瘤中，由于肿瘤细胞的生长方式与非肿瘤细胞有明显差异，造成肿瘤细胞不同的生长微环境，肿瘤细胞诱导EMT则是为了适应各种环境。总的来说，肿瘤发生、发展、侵袭性生长、转移、耐药、复发过程十分复杂，更加深入的研究必将面对很多困难，但随着肿瘤研究的多学科发展，将会促进肿瘤治疗更为经济、高效、实用。