嘌呤能信号在炎症性肠病中的作用研究

胡伟尚，李思慧，吴巧凤

胡伟尚，李思慧，吴巧凤，成都中医药大学针灸推拿学院 四川省成都市610075

核心提要： 近年来，嘌呤能信号在炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)中的作用越来越受到研究人员的重视. 本文通过综述嘌呤能信号在免疫、疼痛等机制参与IBD的病理过程及以嘌呤能受体为靶点的药物研究进展，为IBD发病机理及治疗研究提供线索.

0 引言

嘌呤能信号是指三磷酸腺苷等内源性核苷、核苷酸及其作用受体所构成的嘌呤能信号转导系统，该系统参与机体组织器官多种功能的调节，涉及机体各系统多种疾病的病理过程[1]. 嘌呤能信号通过嘌呤受体触发的信号通路可完成各种功能-从作为神经递质，到自体分泌和旁分泌信号传导，甚至细胞激活和参与免疫反应. 其中由腺苷激活的嘌呤能受体家族为P1受体，该家族包含4个受体亚型： A1、A2A、A2B和A3受体; 由ATP激活的嘌呤能受体家族为P2受体家族，包含两个受体亚型：P2X和P2Y受体. 嘌呤能信号及其受体在肠道神经元系统和上皮细胞中广泛分布和和表达，并通过免疫、疼痛等机制参与炎症性肠炎的病理过程，在炎症性肠炎的发病机制中发挥了重要作用. 研究嘌呤能受体在炎症性肠炎中的具体作用机制，将为其治疗提供新的思路和途径. 本文就嘌呤能信号在炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)中的作用进行了综述.

1 嘌呤能受体在肠道中的分布

1.1 嘌呤能受体在肠道神经元中的分布 肠道神经元系统的功能异常与IBD症状中长期的肠道功能障碍密切相关. 据研究显示，肠炎的严重程度与肠道神经元的密度相关，且肠道神经系统的异常发育可能会导致IBD 的发生. 具体来说，A1受体主要分布于肠肌间神经节的胞体上，可调控末梢释放乙酰胆碱. 通过A1受体在肠肌间神经节上的表达可对肠收缩功能产生调节，且A1受体主要在肠神经元水平上参与抑制肠道运动功能的过程.A2B受体肠肌间神经丛上有广泛表达，并与肠神经胶质细胞的标志性物质-胶质纤维酸性蛋白有相类似的分布. A2A受体在肠神经元系统中有广泛表达，并抑制肠道神经肌肉的收缩运动. P2X3、P2X7和P2Y1、P2Y2、P2Y6受体在肠道中也有广泛分布和表达，其中P2X3可促进肠道蠕动运动. P2X7受体通过促进一氧化氮合酶活性抑制兴奋性胆碱能神经元的活动进而抑制肠道神经肌肉的收缩运动[2]. P2Y1和P2Y2受体也都参与抑制肠道神经肌肉的收缩运动，此外，P2Y6受体也促进肠道神经肌肉收缩运动.

1.2 嘌呤能受体在肠道上皮细胞的分布 肠道物理屏障的主要构成结构为肠道上皮细胞，其对维持正常的肠道功能和稳态起着非常重要的作用. 肠道上皮细胞的屏障功能的减弱可增加肠道通透性，导致肠道免疫细胞与肠道上皮细胞的“交互”异常，进而引起肠道免疫紊乱，导致IBD的发生[3].

经研究表明，腺苷依赖A2B受体来调节肠道上皮细胞中的IL-10水平，进而影响相应肠道组织损伤及炎性细胞的浸润. A3受体在肠道上皮细胞以及肠肌间神经节中均有不同程度的表达，但A3水平的高表达有可能是炎症作用的结果. 在肠道上皮细胞中，P2X3、P2X7和P2Y1、P2Y2受体都有广泛表达. P2X3、P2Y1、P2Y2受体能分别促进上皮细胞氯离子、钠离子、碳酸氢离子及氯离子的释放. P2X7在肠道葡萄糖的吸收起促进作用，且经ATP激活可诱导肠上皮细胞对中性粒细胞的反应迁移. 另外，Annabelle等[4]研究证明上皮细胞P2X7受体参与IEC诱导IL-1释放，介导炎症反应(表1).

2 嘌呤能信号系统广泛参与肠道免疫炎症

免疫炎症在IBD的发病机制中起着重要作用，已有的研究表明免疫缺陷或免疫异常均可导致IBD发病率增高，且会加重已有病情. 嘌呤能受体广泛分布在肠道神经元系统和肠道上皮细胞中，在炎症过程中，免疫细胞激活或肠道上皮细胞受到伤害或死亡时，细胞能很快释放内源性多种核苷酸分子如ATP、ADP等，激活相应的嘌呤受体，进而调节效应免疫细胞迁移和吞噬作用，调控了IBD的免疫应答过程.

2.1 嘌呤能信号与T淋巴细胞 在IBD的病理过程中，T细胞尤其是CD4+T细胞明显增多，激活的T细胞会分泌和释放大量的炎症因子，从而加重肠道炎症反应. T细胞及Treg细胞在IBD的病理过程中发挥着重要的作用. 炎症环境下，腺苷信号大量释放，激活A2A受体，达到减少炎症细胞的浸润、减少T细胞相关炎症因子的分泌的作用. 同时，局部堆积的ATP会激活P2X7受体，从而影响T细胞的分化以及功能，越成熟的T细胞表达P2X7受体水平越高，对ATP或NAD+的敏感性越强. 故ATP或NAD+在不同类型的T细胞中可通过P2X7受体介导不同的效应，从而影响肠道炎症反应. 另外，大量相关炎症因子如IL-6的释放，导致P2X7受体介导的信号传导的增加，有利于T淋巴细胞体内分化为Th17细胞[6，7]，进而影响肠道炎症反应. 另一方面，炎症环境下，激活的A2A受体可增强Treg细胞的功能，Treg细胞具有免疫抑制功能，参与多种免疫性疾病的发生、发展过程[8]，可维持免疫耐受以及保护肠道黏膜. Deaglio等[9]认为小鼠Treg细胞表达高水平的胞外酶，如CD39和CD73，在降低促炎ATP浓度的同时还会增加局部微环境中抗炎腺苷的浓度.Schenk等[6]认为，ATP可激活Treg细胞上的P2X7，使Treg细胞的抗炎能力降低并促进其凋亡. Figliuolo等[10]的研究也证明细胞外ATP-P2X7通路引发Treg细胞的死亡，从而加重肠道炎症.

表1 嘌呤能受体在肠道神经元和肠上皮细胞的主要作用[5]

2.2 嘌呤能信号与巨噬细胞及中性粒细胞 在IBD的急性期，巨噬细胞和中性粒细胞的数量明显增多，由于巨噬细胞在肠道内作为主要的吞噬细胞，故在IBD的发病中具有重要作用[11]. A1受体对中性粒细胞和单核细胞的激活上调可能作为炎症级联的初始通道，促进免疫细胞迁移和激活. A2A受体减少黏膜炎症细胞的浸润，运用高选择性A2A受体激动剂可以减少中性粒细胞的浸润. A3受体在巨噬细胞及其他免疫细胞中都有表达，并且A3受体激动剂被认为通过影响AKt和NF-KB通路达到抑制免疫反应的作用. 在UC以及CD鼠模型中可发现P2X7受体的巨噬细胞会明显增多，进而导致相应炎性因子的增多，参与IBD的病理反应. Layhadi等[12]研究表明，细胞外ATP通过激活P2X4受体，促进巨噬细胞分泌CXCL5，与CXCR2选择性表达的中性粒细胞结合. P2X4受体与P2X7受体相互作用仍然是一个有争议的问题[13].然而，这两种P2X受体都被认为是各种炎症性疾病的潜在药物靶点.

2.3 嘌呤能信号与树突细胞 树突状细胞在肠道免疫反应的起始和调节中非常重要[14]. A1受体在未成熟的树突状细胞上高度表达，这可能是初始树突状细胞聚集到炎症部位的原因. 活化的成熟树突状细胞也高度表达A2A受体，刺激多种抗炎途径. 在肠道炎症环境下，树突细胞的P2X7受体被激活，通过NLRP3/Caspase-1炎性小体的途径促进IL-1β的成熟及释放，进而加重病情. Ben Addi等[15]用P2Y12基因敲除小鼠模型，观察到ADP-P2Y12受体通路能显著促进树突状细胞对OVA抗原的吞噬和呈递作用，并激活OVA特异性的体液免疫和细胞免疫应答. 在浆细胞样树状突细胞(plasmacytoid dendritic cells，PDCs)中还观察到，ATP等胞外核苷酸分子能显著上调CD86、CD83和CD62L等分子的表达; 进一步分析表明，PDCs高表达多种P2Y嘌呤受体，暗示ATP等胞外核苷酸通过激活P2Y受体调节了PDCs的成熟分化[16].

2.4 嘌呤能信号与细胞因子 细胞因子通过结合相应受体，调节细胞生长、分化和效应，调控免疫应答. 在肠道中，嘌呤能信号与细胞因子水平密切相关. A2A受体的激活可以减少中性粒细胞黏附分子的表达，从而达到减少黏膜炎症细胞聚集的作用，TNF-α、MAO和IL-1β等的产生也会明显减少，对肠道炎症起保护作用. A2B受体从上皮源性旁分泌中向中性粒细胞发出信号，是调节肠道上皮的炎症反应的一种手段. 一方面，A2B受体在IBD的病理过程中发挥着促炎的作用，基因敲除A2B受体或使用其高度拮抗剂均显示促炎因子TNF MRNA水平的降低. 另一方面，A2B受体可介导IL-6分泌，而IL-6已经被证明可以增加中性粒细胞的细胞内钙含量，与中性粒细胞脱颗粒相关[17]. 因此，而A3受体激动剂IBMECA可减少炎症因子、趋化因子的浸润，并且A3受体可刺激磷脂酶C和细胞内Ca2+离子，特别是在空肠和近端结肠. Kurashima等[18]研究表明ATP作用于P2X7受体激活肥大细胞不仅能诱导脱颗粒和炎性细胞因子，还能诱导趋化因子白三烯B4(LTB4)用于招募炎症细胞(如中性粒细胞)并随后使其恶化肠道炎症. 因此，以ATP介导的肥大细胞激活为目标可能是一种很有前途的预防和治疗肠道炎症的新策略. Seiffert等[19]研究表明不同的P2Y受体对细胞表达黏附分子、分泌炎症因子或调节效应细胞的招募作用，促进了炎症反应. 比如P2Y6受体可调节多种炎性因子的表达，如TNF-α、MCP-1、MIP-1α/β和IL-6等[20]，并在体内促进单核/巨噬细胞等招募作用，提高小鼠清除入侵细菌的能力[21].

3 嘌呤能信号参与 IBD疼痛机制

大量研究发现，嘌呤能信号在IBD中除了具有强大的炎症和免疫调节作用，在疼痛信号传导中也扮演着重要角色. 嘌呤能信号可作用于疼痛机制的外周感觉系统以及中枢系统. 目前认为内脏高敏感是引起IBD疼痛的主要病理生理机制. 内脏感觉通过胞体位于脊髓背根神经节(dorsal root ganglia，DRG)的脊髓内脏传入神经传递到次级感觉神经元，进而投射到中枢神经系统[22].

3.1 嘌呤能信号在外周系统的作用机制 嘌呤能信号在外周系统中参与疼痛主要涉及ATP、嘌呤能受体亚型、初级感觉神经元等. 初级感觉神经元除含有相关神经肽外，也表达特异性ATP受体通道如P2X3，介导相关电生理和生物反应，共同参与痛觉的神经传递和调制.在疼痛信号的传递过程中，大量研究发现，参与IBD疼痛信号的产生和传导的受体主要是P2X3受体以及P2X2/3亚型受体表达于脊髓背根神经节. 研究发现，在结肠炎模型中，ATP的释放以及介导伤害性感觉神经反应的P2X3及P2X2/3受体得到加强; 表达于结肠肌间神经丛的P2X3受体在肠易激综合征内脏疼痛大鼠模型中有异常的升高[23]. 这说明P2X3受体的确参与了IBD疼痛及功能障碍的过程. P2X3在疼痛信号传递的具体过程中的参与原理和机制如下： 在炎症环境中，周围细胞由于受到损伤、内脏牵拉或交感神经兴奋等刺激，会释放大量ATP及其降解产物，导致其在局部高浓度并向邻近区域扩散[24]，作用于初级传入神经的P2X3受体或者异源性P2X2/3受体，受体去极化产生动作电位导致疼痛. 从黏膜上皮细胞释放的ATP在低阈值肠道感觉神经纤维中激活P2X3受体进而调节肠道反射(包括肠蠕动)引起IBD症状中的腹胀; 同时在高阈值外在感觉神经纤维激活P2X3受体可介导通过感觉神经节到中枢神经系统疼痛中枢的伤害性信息的传导[23]，进而引发内脏高敏感和疼痛.

除P2X3受体外，其它嘌呤受体可能也参与了IBD疼痛机制，如研究[25]阐明了P2X7受体的激活可促进IBD炎症和细胞死亡. 在P2X7受体敲除的动物模型中，都未观察到相应炎症、疼痛等表现的进展[26]. 通过应用P2X7受体拮抗剂发现，其可抑制痛觉信息传递，降低腹腔注射乙酸致内脏痛大鼠内脏痛指数，说明P2X7在IBD中存在易化作用. 其机制为： 胞外ATP受刺激后与P2X7受体结合，离子通道开放，Na+、Ca2+内流、K+外流产生动作电位，P2X7 MRNA以及蛋白表达增多，脊髓背根神经节GFAP异常表达，产生伤害性信息传递以及内脏痛效应[27].

3.2 嘌呤能信号在中枢系统的作用机制 神经胶质细胞在整个痛觉信息传导和外周神经损伤中扮演重要角色，ATP通过结合嘌呤受体，激活相关的小神经胶质细胞，小胶质细胞对周围组织损伤反应迅速，首先表现为吞噬细胞表型，其次会释放大量炎性介质，这种促炎细胞外环境有助于IBD慢性炎性疼痛的形成. 大量的研究发现，疼痛等感觉信息的传导与痛觉敏化的形成过程中，小胶质细胞表面P2X4、P2X7、P2Y12 受体的活化起到了重要作用[24，26-29]. 小胶质细胞表面的P2X4、P2X7、P2Y12 受体等被激活均可使磷酸化p38MAPK表达增强[30]. P2X4、P2X7、P2Y12三种不同类型的受体激活后的嘌呤信号通路，可被细胞内的p38MAPK整合成共同的路径，进一步引导下游信号分子、细胞因子等的合成与释放而致内脏痛.

4 嘌呤能信号及其受体为靶点的药物

目前，嘌呤能信号及其受体被认为是治疗炎症性肠炎的潜在靶点. 但在相关药物的研制方面，目前大部分研究局限于动物实验阶段.

4.1 P1受体靶向药物 大多数的实验模型研究认为A2A受体激动剂对肠道炎症具有显著有益作用. A2A受体激动剂ATL-146[31]和ATL-313[32]显著降低了结肠黏膜炎症、促炎细胞因子水平和白细胞浸润，并提高了抗炎细胞因子水平. 最近，Pallio等[33]证实了了A2A受体激动剂刺激脱氧核糖核苷酸在两种实验性结肠炎模型中可对抗出血性腹泻，恢复受损上皮和黏膜完整性.

Kolachala等[34]发现A2B受体拮抗剂ATL-801对实验性结肠炎小鼠炎症参数有一定的改善作用，对疾病进展有益. 但Frick等[35]报道了A2B受体拮抗剂PSB1115在dss诱导结肠炎急性期产生的有害影响，因此质疑A2B受体拮抗剂在IBD治疗中的疗效.

另一种有希望的治疗肠道炎症疾病的方法是A3A受体激动剂的药理刺激. Ren等[36]的一项研究说明A3A受体激动剂的药理刺激具有抑制DSS结肠炎小鼠的结肠内上皮细胞NF-kB通路d 作用，NF-kB的抑制激活和IkBa磷酸化可引起结肠上皮促炎细胞因子的炎症表达减少.

4.2 P2受体靶向药物 P2X7受体拮抗剂AZD9056是唯一在临床实验中展现良好疗效的嘌呤能受体靶向药. Eser等[37]进行了一项研究对象为34名患者(24例AZD9056例，10例安慰剂)进行了一项临床双盲随机对照IIa期研究，以评估口服P2X7受体拮抗剂AZD9056在中度至重度CD患者中的疗效和安全性. 结果显示AZD9056耐受性良好，无严重不良事件报告. AZD9056有潜力改善中度至重度CD患者的症状，特别是腹痛较为明显的炎症性肠炎患者.

另外，在大鼠三硝基苯磺酸结肠炎模型中，使用P2X7受体抑制剂A740003可降低t细胞和巨噬细胞在固有层的浸润，随后降低组织TNF和IL-1b浓度，从而减轻炎症程度[38].

5 结论

随着对嘌呤能信号在IBD中的作用研究的深入，越来越多的研究开始关注这一领域，以期找到新的靶向治疗药物. 但是，目前嘌呤能信号在IBD中的确切作用机制仍不清楚，除了参与免疫、疼痛等病理环节，嘌呤信号系统是否还通过神经-内分泌-免疫网络或脑肠轴等参与IBD？肠道菌群等新兴领域是否与嘌呤信号系统密切相关？这些问题都有待进一步研究. 总之，随着相关领域的深入探索，作为机体内广泛存在的物质和信号基础，嘌呤信号在IBD发病及治疗中的作用将越来越明晰.