简化低温放热法用于葡萄叶片耐霜冻能力评价

孙鲁龙 ，丁家宁，翟 衡，杜远鹏※

（1. 山东农业大学园艺科学与工程学院/作物生物学国家重点实验室，泰安271018； 2.旱区作物逆境生物学国家重点实验室•西北农林科技大学园艺学院，杨凌 712100； 3.陕西省苹果工程技术研究中心，杨凌 712100）

0 引 言

低温胁迫对葡萄的生长和品种区域化都具有重要的影响[1-4]。葡萄在年生长周期中容易遭受的低温胁迫主要有休眠季冻害以及生长季霜冻害2 种。相对于休眠季冻害，生长季霜冻害对葡萄的影响更大。2015 年11 月23—24 日, 山东省发生了大范围突发性霜冻天气, 许多葡萄种植区遭受了前所未有的损失。山东省以济宁地区受害最为严重, 上千亩葡萄在未落叶之前遭遇强低温, 致使葡萄叶片、枝条甚至是果实严重受冻, 造成了巨大的经济损失。2017 年4 月份，席卷欧洲的霜冻导致欧盟葡萄产量为36 a 来历史最低。有研究表明，随着全球气候变化的加剧，霜冻对果树栽培所构成的威胁越来越大[5]。1

抗霜冻品种的选育与应用是提高葡萄抗霜能力的根本途径，而在开展育种工作之前需要对种质资源的抗霜冻能力进行评价。目前国内外在植物抗霜冻能力的鉴定方面还不成熟，这主要体现在评价植物耐霜冻能力的指标不健全上。常用的抗寒性鉴定指标主要有组织褐变等形态指标[6]，半致死温度等温度指标[7]，以及其他生理、生化指标[8-11]。从理论上讲这些指标都能反映植物的抗霜冻能力，但不同指标的获取方法往往会限制其在植物耐霜冻评价中的应用。比如大多数的生理、生化指标，其测定过程往往是损伤性的。此外为了解生理、生化参数随时间的变化，就需要在霜冻处理过程中连续取样，不仅耗时还会造成取样期间测定系统中温度的变化，影响测定结果的准确度。因此如何在不影响霜冻处理过程的情况下获得更多可靠的信息以评价植物耐霜冻能力是值得探索的问题。

低温放热分析(low temperature exotherms，LTE)是一种通过连续监测、记录低温环境下组织放热过程，并提取有效信息用于评定植物组织抗寒性的一种技术[12-13]。低温放热法除能获得反映植物组织抗寒性的常规指标（如半致死温度，LT50）外，还能提供更为丰富的信息。Gu[14]采用低温放热法不仅测出了休眠季葡萄冬芽的半致死温度，同时还提出了当材料的半致死温度（LT50）相同时，以20%~80%材料致死期间的拟合直线斜率（QLT）作为补充参数，用于比较材料对低温的敏感性。高振等[15-17]在分析葡萄根系、枝条的低温放热曲线时发现，葡萄根系、枝条的低温放热曲线存在2 条突变高峰，并进一步揭示了其与韧皮部、木质部抗寒性的关系。

虽然低温放热法在葡萄抗寒性鉴定中发挥了重要的作用，但是到目前为止，该方法主要用于休眠季根系、芽 和枝条的抗寒性鉴定，在生长季叶片抗寒性的鉴定中并未得到有效应用。此外，传统的低温放热法需要的硬件系统比较多，操作繁琐，难以实现大量、快速、高效的测定。本研究采用开发的多点测温系统对传统低温放热法进行简化以适应叶片耐霜冻能力评价的应用需求，同时比较不同葡萄品种叶片在春季的耐霜冻能力，以期为评价葡萄叶片耐霜冻能力提供技术参考和理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验品种及样品采集

试验所用的品种有5 a 生玫瑰香、赤霞珠、雷司令、小芒森、美乐、霞多丽、巨峰、夏黑、摩尔多瓦、威代尔、Becker hance、Frontenac、SO4、140Ru；2 a 生华葡（表1）。所有植株南北行向种植, 株、行距2 m×3 m。除夏黑、摩尔多瓦为棚架栽培外, 其他品种均为篱架栽培, 单干双臂整形。

采样及试验时间为2016 年5 月20—30 日， 每次采样时间均为早上08:00—09:00 之间。采样时将新梢梢尖下第1 片展开叶连同叶柄采下。为了防止叶片失水，样品采下后立即放在自封袋中，做好标记置于冰盒内保鲜，尽快带回实验室用于试验，或暂时保存于4℃冰箱内备用，一次采集的样品在24 h 之内用于试验。

表1 试验品种 Table 1 Cultivars used in study

1.2 低温处理

采用高低温湿热测试箱(苏州智何环境试验设备有限公司)对材料进行低温处理，降温程序设置为：10 min 内从室温匀速降到4 ℃，30 min 内从4 ℃匀速下降到-10 ℃。低温处理期间，利用与北京农业智能装备技术研究中心联合开发的多点测温系统检测叶片温度的变化。多点测温系统有9 个样品槽，每个样品槽的中心固定1 个温敏传感器（精度为±0.001 ℃），每秒记录1 次温度，同时可以将样品槽的温度及时传到主机上，并以实时曲线的形式显示。试验时，将9 个样品槽按“九宫格”形式紧密排列，最中间的1 个样品槽中不放样品用于监测气温，其余8 个设置样品。设置样品时，将叶片紧贴在样品槽中的温度探头上，叶片上部覆盖一层铝箔纸以防止叶片失水并保持叶片与外界良好的热量交换。每1 个品种重复21 次。

1.3 数据处理及评价方法

利用Excel 2013 进行简单数据计算，采用Origin 9.0绘制葡萄叶片温度随气温降低的变化规律图，采用SPSS 21.0 进行相关性分析、单因素方差分析（多重比较采用LSD 法）和聚类分析（欧氏距离最长距离法）。

2 结果与分析

2.1 葡萄叶片典型低温放热曲线

在低温处理过程中，叶片表面温度呈现规律性变化（图1）。以低温处理‘140Ru’叶片为例，随着环境温度的降低，叶片表面的温度也以近似相同的速率逐渐降低，说明此阶段叶片表面温度主要受周围环境影响。当环境温度降至一定程度后，叶片内部因水分开始处于过冷却状态，导致叶片表面温度不再随环境温度的降低而降低，而是在一定的低温水平（过冷点，T1）维持一段时间t1, 随着温度降低，叶片内部水分的过冷却状态被打破，水分凝结并释放出大量热量，导致叶片温度从T1迅速升高到最高水平（冰点，T2），从T1到T2所需的时间为t2。随着环境温度的进一步降低，因水分凝结而释放的热量被周围环境吸收，导致叶片温度在T2维持一段时间t3后逐渐下降，并最终与环境温度趋于一致，从叶片温度达到T1到叶片温度的变化与气温变化一致期间，叶片温度曲线与气温基线构成形状的面积为S。不同品种在同一降温条件下获得的典型参数如表2 所示。

图1 葡萄叶片温度随气温降低的变化 Figure1 Variety of grapevine leaf temperature as air temperature dropped down

表2 15 个葡萄品种叶片低温放热曲线参数（平均值±标准差） Table 2 Parameters of LTE curves in leaves of 15 grapevine cultivars （Means±SD）

2.2 不同品种低温放热曲线参数方差分析

为筛选出可用于评价不同葡萄品种叶片抗霜冻能力的低温放热曲线参数，将15 个品种的6 组低温放热曲线参数首先进行相关性分析，结果发现不同的参数之间的相关性存在较大差异。T1和T2、S 在0.01 水平上显著正相关；T2与t3在0.05 水平上显著正相关，与S 在0.01 水平上显著正相关；t2和t3在0.05 水平上显著正相关，其他参数之间正相关，但相关性不显著（表 3）。说明从葡萄叶片低温放热曲线上提取的参数之间存在一定的关联性，可以采用降维处理的方法简化变量用于后期综合评定叶片的抗霜冻能力。

表3 各参数的相关系数 Table 3 Correlation coefficient matrix of parameters

单因素方差分析结果显示（表 4），不同品种的T2、t2和S 存在显著性差异，因此可以单独用于区别和评价不同葡萄叶片耐霜冻能力，T1、t1和t3不具有显著性差异，说明这3 个指标不能区别葡萄叶片的抗霜冻能力。

2.3 低温放热曲线有效参数的隶属函数分析

采用单一指标评价葡萄叶片的抗霜冻能力可能存在片面性，因此本研究采用隶属函数法，结合T2、t2和S 的评价结果对15 个品种叶片的耐冻能力进行综合评定。参考高振的方法[16], 对不同葡萄品种的T2、t2和S 分别计算隶属函数值, 并求出隶属函数值的平均值以反映叶片的综合抗霜冻能力(表5)。从表5 可以看出, 不同品种的隶属函数值差异比较大,其中夏黑的最高(为0.865); 玫瑰香的最低(为0.096)，说明不同葡萄品种叶片的抗霜冻能力差异较大。对15 个品种的平均隶属函数值采用最短距离 法聚类(图2), 结果显示15 个品种叶片的耐冻能力可以划分为3 类: I: 玫瑰香和Frontenac, 平均隶属函数值为0.113; II: 夏黑，平均隶属函数值为0.865; III: 其他品种, 平均隶属函数值为0.487。由于T2、t2和S 之间存在正相关关系，而一般认为冰点T2越小，组织器官的抗寒性越好，因此T2、t2和S 三者的隶属函数值越小抗冻能力越好。综合判断，在所选择的15 个葡萄品种中，玫瑰香和Frontenac 的抗霜冻能力最好，夏黑的抗霜冻能力最差，其他品种的抗霜冻能力介于二者之间。

表4 低温放热曲线参数单因素方差分析结果 Table 4 Univariate analysis of parameters derived from LTE curves

表5 15 个葡萄品种叶片的抗寒性隶属函数分析 Table 5 Affiliation function analysis of cold hardiness in leaves of 15 grapevine cultivars

图 2 根据隶属函数值对15 个葡萄品种叶片抗冻能力聚类 Figure 2 Cluster analysis of cold hardiness of 15 grapevine cultivars leaves according to functional values

3 讨 论

在有关葡萄抗寒鉴定的研究中，针对根系和休眠期枝干的研究较多[18-22]，但对生长季叶片耐霜冻能力的研究却很少[23-24]。本研究在前期试验的基础上，进一步分析了不同葡萄种质资源嫩叶的低温放热曲线，从低温放热的角度对葡萄叶片的耐霜冻能力进行了综合评价。

低温放热法在分析葡萄根系、休眠芽、枝干的抗寒性方面应用比较广泛，但在叶片方面还未见报道。本试验通过简化低温放热法，获得了典型的葡萄叶片低温放热曲线。从试验结果看，叶片的低温放热曲线只有一个突变高峰，这与根系、休眠芽、枝干的低温放热曲线存在多个放热高峰[15-17]有显著区别。这可能是因为相对于根系、休眠芽和枝干而言，叶片特别是新生嫩叶，组织结果较为简单，不存在类似于根系、休眠芽和枝干那样的多层组织分化，因此嫩叶不具备多层的水分分布，在较低温度环境下，叶片中的水分会一次性凝结，因此在低温放热曲线上只显示一个放热高峰。

典型的葡萄叶片低温放热曲线上包含了很多有价值的信息，如何识别这些信息并将其与叶片的抗霜冻能力联系起来是本研究的重点。在本研究中发现，叶片的低温放热曲线上至少存在6 个与抗寒性相关的指标，即过冷点（T1）、过冷点维持时间（t1）、过冷点升温到冰点的时间（t2）、冰点（T2）、冰点维持时间（t3）以及放热曲线与气温基线围成的面积（S）。这些指标与抗寒性是否相关首先在于这些指标能否单独将不同的品种区别开。经单因素方差分析发现，6 个参数中只有T2、t2、和S 3 个参数在品种之间存在区别，而其他参数，特别是过冷点T1在不同品种间无显著差异。过冷现象是植物适应冻害的一种重要机制，但是据本研究发现，葡萄嫩叶对霜冻低温的适应机制可能并不是过冷却效应，这与常规认识存在较大区别，葡萄叶片响应霜冻低温的生理生态机制有待于进一步深入研究。

T2、t2、和S 虽然在不同的品种之间存在显著性的差异，但其与抗寒性的关系仍不清楚。一般而言，冰点T2可以被用于组织器官的抗寒性评价，冰点越低说明组织器官的抗冻能力越强。由此推断，与冰点T2相关的参数也可能用于抗寒性评价。在各参数的相关性研究中发现，S 、t2与T2都存在正相关关系，因此S 、t2的值越小，组织器官的抗冻能力越强。

采用单一指标进行评价往往会存在片面性，为此本研究结合隶属函数法，综合分析了不同品种的耐霜冻能力，但其鉴定结果与采用其他方法得出的结果相比存在一定的差异[23-24]。这可能是由于不同方法所反映的信息各有侧重。此外，植物抗寒性与物候期存在密切的联系，不同的品种物候期存在差异，因此不同的品种不一定会在同一时间遭受霜冻。本研究以及前期研究所获得的评价结果仅可作为所有品种都有嫩叶发生时遭受霜冻的参考。由于霜冻在试验地区并不是每年都会发生，因此以大田环境下霜冻发生时不同品种抗霜冻能力的差异校正本研究结果，综合不同技术手段建立植物抗霜冻能力鉴定的标准方法，全面认识葡萄叶片抗霜冻机制是下一步研究的重点。此外，在本研究中，葡萄叶片的低温放热曲线涉及到许多典型参数，这些参数是否与特定的生理生化过程相联系也有待于进一步研究。

4 结 论

为了从低温放热角度了解葡萄叶片的耐霜冻特性，鉴定不同葡萄品种叶片的耐霜冻能力，本文对15 个葡萄品种萌芽期的嫩叶进行了人工霜冻处理，利用新开发的多点测温系统获得霜冻过程中葡萄嫩叶的低温放热曲线，提取有效参数，用于比较不同葡萄品种的耐霜冻能力，得出以下主要结论：

1）低温放热法可用于葡萄叶片耐霜冻能力评价。叶片冰点T2、过冷点升温到冰点所需时间t2和放热曲线与基线围成的面积S 可单独用于比较不同品种叶片的耐霜冻能力。

2）综合考虑T2、t2和S 3 个指标，可将供试葡萄品种叶片的耐霜冻能力分为3 类：Ⅰ 玫瑰香和Frontenac, 耐霜冻能力较强，平均隶属函数值为0.113；Ⅱ 夏黑，耐霜冻能力最弱，平均隶属函数值为0.865；Ⅲ 其他品种，耐霜冻能力介于Ⅰ、Ⅱ之间，平均隶属函数值为0.487。