赤丸水煎液的心脏毒性作用研究※

●晁利芹 潘晓丽 王 付

赤丸是《伤寒杂病论》中辨治寒痰的重要用方之一，辨治“寒气，厥逆”。导师王付教授根据张仲景用方要点并结合自身临床经验常用于辨治闭塞性脉管炎、深部静脉炎以及慢性胃炎等。其方由乌头、半夏、茯苓、细辛所组成，其中“乌头与半夏”为用药禁忌中“十八反”内容之一。为此笔者查阅了相关赤丸的实验研究和临床运用情况，发现其研究仅仅局限于相反药对及单味药[1]，故本课题重点开展赤丸方药配伍的整体性及其相互关联性的慢性毒性实验研究，观察其水煎液对大鼠心脏的毒理作用，以期为临床安全用药提供科学的实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物健康清洁级Wistar大鼠，雌雄各半，共80只，体质量200±10g，购于河南省实验动物中心，合格证号：SCXK（豫）2005-0001。动物房内的饲养环境：温度22℃±3℃，湿度60%±10%，声响＜60分贝，无对流风，人工昼夜（12h／12h）。大鼠饲料由河南省实验动物中心提供。本研究涉及所有实验均通过河南中医药大学动物实验伦理委员会。

1.2 试剂与仪器75%乙醇：100mL，洛阳德之康生物工程有限公司，批号：090706；95%乙醇：2500mL，卫辉市众诚消毒制剂有限公司，批号：090206；乌拉坦：上海曹扬第二中学化工厂生产，批号：080517；肝素钠注射液：2mL，12500U，江苏万邦生化医药股份有限公司，产品批号：09 061012；甲醛溶液：天津市博迪化工有限公司，500mL/瓶，批号：20 080823；BL-420生物机能实验系统检测心电图：成都泰盟公司；全自动生化分析仪：型号AT-738，上海安泰分析仪器有限公司；生物显微镜：型号OLYMPUS-CX40，日本奥林巴斯公司；轮转式切片机：型号LEICA2025，德国徕卡仪器有限公司；电子天平：型号AE-240METTLER；赛多利斯精密天平：型号BS210S，北京赛多利斯天平有限公司；电热恒温干燥箱：北京市永光明医疗仪器厂；LEICARM2135型石蜡切片机：德国LEICA公司。

1.3 实验药物及制备实验药物：于郑州市华龙中药行购买茯苓、生川乌、辽细辛、法半夏四味中药材，并由河南中医药大学药学院鉴定合格。

药物制备：依据全国高等中医药院校《金匮要略》赤丸方的用量按重浸渍法[2]提取药物成份，并浓缩为浓度200%（2g生药/mL）的溶液。制备方法如下：取茯苓12g、生川乌6g、法半夏12g、辽细辛3g，依比例计算、称量、粉碎所需受试药物，将上药混合用实验所需的水溶液分三次提取有效成分，将三次浸提液混合过滤，调整至实验所需容积，加热沸腾后持续煎煮60min，滤其药液；所得药液的量即为当天各给药组所需浓度为200%（2g生药/mL）的溶液。

1.4 实验方法（1）实验动物分组：80只Wistar大鼠，雌雄各半分笼，适应性饲养1周后，随机每20只雌雄各半大鼠分为1组，共分4组，即赤丸水煎液高剂量组、中剂量组、低剂量组、正常对照组。

（2）实验分期：实验全程分为灌胃期和恢复期两期。灌胃期是大鼠适应性饲养1周后，持续灌胃90天的这个时期。恢复期是灌胃结束后，每组随机选10只大鼠处死检测，剩余的40只大鼠停止灌胃，继续一般饲养3周的这段时间。

（3）给药方法：各给药组根据人与大鼠的体表面积比，即大鼠用药为人用药量的7倍，依次按33g、16.5g、5.5g生药/（kg·d）剂量灌胃，对照组用蒸馏水灌胃，灌胃体积为同等体重条件下高剂量组大鼠灌胃时所需药液的剂量。每日定时（15：00）灌胃1次，6次/周灌胃，每周日检测大鼠的体重，每周根据称重情况调整给药剂量，各组连续灌胃90天。

（4）实验样品收集：末次灌胃后，大鼠禁食不禁水2h，腹主动脉取血于普通的真空采血管中，4℃，3000r/min，离心15min，收集上清液，于-80℃保存备用。采血完毕后，剖腹迅速取出完整心脏，除净周围的结缔组织，切取大鼠同一部位的心脏组织，放入装有4%甲醛溶液的标本瓶里，固定48h后，脱水，置于包埋盒中，做好标记，切片，HE染色，在光学显微镜下进行观察心脏组织病理学变化。

（5）一般中医症候指标观察：神志、皮毛、呼吸、行动、饮食、二便、分泌物等表现。

（6）心电图检测：灌胃前，每组随机选10只大鼠在乙醚麻醉作用下采用BL-420生物机能实验系统进行心电图检测，并于末次给药后的次日的上午，进行相同的心电图检查。

（7）心功能指标测定：LDH、CK。在灌胃期结束末次大鼠心电图检测后，腹腔注射20%的乌拉坦（5mL/kg）进行麻醉，然后，从大鼠的腹主动脉取5mL血液，离心，存放，检测。

（8）恢复期大鼠的检测方法：进行与给药期相同的检测，借此观察赤丸方的毒性反应是否具有可逆性，抑或是否出现迟缓性的毒性。

1.5 统计分析方法采用SPSS18.0统计软件对实验所得数据进行整理和分析，计数资料用χ2检验，计量资料用t检验，各组间比较采用单因素方差分析。以P＜0.05为有统计学意义，P＜0.01为有显著统计学意义。

2 结果与分析

2.1 赤丸水煎液对大鼠一般生长情况的影响在实验过程中，除赤丸水煎液高剂量组大鼠外，其余各组大鼠在饲养期间，状态良好，精神佳，活动灵活，皮毛光滑有色泽，食欲正常，未见异常分泌物。赤丸水煎液高剂量组大鼠饲养期间，精神不振，行动迟缓，皮毛不光滑，腹部微胀，食欲差并伴有不同程度的腹泻。其中有2只大鼠在灌胃的第4、5周出现异常反应，体重增长较正常大鼠的速度慢，于第11、12周时，有5只大鼠出现了中毒反应，第67、83天，有2只大鼠死亡，随即解剖2只大鼠制作心脏病理切片，观察心脏组织形态。余实验组没有发现异常情况。

2.2 赤丸水煎液对大鼠体重的影响灌胃前：不同大鼠实验组间体重无显著差异（P＞0.05）；灌胃期：与正常对照组比较，赤丸水煎液低、中剂量组大鼠体重无显著性差异（P＞0.05），赤丸水煎液高剂量组大鼠的体重明显增长缓慢（P＜0.05），具有统计学意义。在动物试验中，体重数值的高低可以作为整个机体变化的一个重要指标，在本课题的赤丸水煎液慢性毒理试验过程中，每周称量大鼠体重，既是调整给药剂量的依据，又是观察大鼠毒性反应的一个重要试验指标。本课题结果证实，赤丸水煎液高剂量组大鼠的体重受到了很大的影响，余给药组大鼠的体重未受到影响。恢复期：不同给药组大鼠的体重与正常对照组比较无显著性差异(P＞0.05)。提示：长期大剂量口服赤丸水煎液对大鼠体重的增长具有影响作用，然而，一旦停止给药一段时间后，就可恢复到正常体重。见表1。

2.3 赤丸水煎液对大鼠心电图的影响灌胃前：与对照组比较，不同赤丸水煎液剂量组大鼠的心电图包括心率，均无显著性差异（P＞0.05）。灌胃期：与对照组比较，赤丸水煎液低、中、高剂量组大鼠的心电图、心率均无显著性差异（P＞0.05）。恢复期：不同给药组大鼠的心电图、心率与正常对照组相比也无显著性差异（P＞0.05）。本结果心率平均在335次/min。II、Ⅲ、avF导联p波直立高尖，avR导联倒置，时限、振幅正常，QRS波V1导联主波向下，Ⅱ、Ⅲ、aVF向上，时限及振幅未见异常，J点抬高，T波前支陡后支缓。可以看出，长期灌服低、中、高剂量的赤丸水煎液对大鼠心脏无毒性反应。心电图见图1，心率结果见表2。

表1 各组大鼠体重比较（g，）

表1 各组大鼠体重比较（g，）

注：与对照组比较，★P＜0.05

图1 赤丸方水煎液对大鼠心电图的影响

2.4 赤丸水煎液对大鼠心肌酶的影响灌胃期：赤丸水煎液不同剂量组大鼠的LDH、CK与正常对照组比较无显著性差异（P＞0.05）。本结果证实，赤丸水煎液低、中、高剂量组大鼠的心肌细胞均未受到损害。恢复期：不同赤丸水煎液实验组大鼠的LDH、CK与正常对照组比较，无显著性差异（P＞0.05）。本课题结果说明，不论灌胃期，还是恢复期，赤丸水煎液低、中、高剂量组大鼠的心肌细胞均未受到损害。见表3。

表2 各组大鼠心率比较（次，）

表2 各组大鼠心率比较（次，）

2.5 赤丸水煎液对大鼠心脏的组织形态的影响整体情况：不同实验组大鼠心脏的结构完整，表面光滑，形态体积、色泽均正常，未见水肿、充血、糜烂，组织无隆起、脱落，触及质地也未发现异常。

形态组织学观察：在灌胃期、恢复期，在光镜下观察实验各组大鼠的心脏结构形态结果具有一致性，均可见到由心外膜、心肌膜、心内膜构成的心脏壁，心肌细胞排列整齐，核居中，无变性、坏死等损伤性改变，间质内未见炎性细胞浸润、缺血、水肿等病理性改变。

表3 各组大鼠LDH、CK变化比较（U/L，）

表3 各组大鼠LDH、CK变化比较（U/L，）

本课题实验结果表明，在灌胃期及恢复期，各组大鼠的心脏组织形态皆未出现异常。见图2。

图2 光镜下赤丸水煎液对大鼠心脏形态学的影响

3 讨论

王付教授在临床中经常辨证使用赤丸方加味治疗各种疑难杂症[3]，疗效卓著。由于赤丸组方之药性的特殊性，所以进行该方的动物实验研究是很有必要的。基于本实验前期发现赤丸水煎方对机体肝、肾、内分泌系统均无毒性反应[4]，本研究则进一步探讨赤丸水煎液有无心脏毒性的影响，借此观察存否心脏的急毒与慢毒反应，是否具有可逆性。在给药期，高剂量组大鼠体重增长显著缓慢，但停药21d后，大鼠体重恢复到正常水平。不论在给药期还是恢复期，各组大鼠的心率、心电图、心肌酶（LDH、CK）及心脏组织病理学均未现病理性改变。

赤丸方中虽然含有有毒中药，且有十八反的配伍禁忌药物，但是在研究中发现低、中、高浓度的赤丸水煎液对大鼠心脏均未产生不良的反应。赤丸方中，茯苓性味甘、淡、平，无毒副作用，且有免疫调节和保肝护肝的作用。细辛，辛、温，有小毒。《中国药典》将细辛的成人日用量定为不得超过3g[5]。在赤丸方中细辛用量为一两（3g），属安全范围。乌头辛、甘、大热，有大毒，其毒性可随煎煮时间延长而减弱或消失[6]。半夏辛、温，有小毒。半夏与乌头属于十八反，属配伍禁忌。但从药理毒理相互作用上看，其毒性很可能被消除或减弱。乌头的毒性主要为心脏的毒性及神经系统毒性。而现代药理研究表明半夏具有镇咳、镇吐、抗心律失常的作用，能够很好的拮抗乌头引起的心脏毒性[7-9]。同时，细辛还具有强心、扩血管、降压及保护心肌的作用。全方半夏燥湿化饮，茯苓利湿化饮，乌头、细辛既能通阳散寒又能温化寒饮，四药相互为用，以建其功[10]。

综上所述，赤丸方水煎液对心脏未见毒性反应，为临床治疗寒饮内阻之痼疾提供了动物实验依据。