奶牛副结核病例的临床诊断

赵俊亮，吴建勇，葛建军，王登峰*

（1.新疆呼图壁种牛场有限公司，新疆 昌吉 831100；2.新疆畜牧科学院兽医研究所（新疆畜牧科学院动物临床医学研究中心），乌鲁木齐 830000）

副结核病是由副结核分枝杆菌（Mycobacterium paratuberculosis）感染引起的以顽固性腹泻、渐进性消瘦、肠黏膜增厚并形成皱褶为特征的慢性消化道疾病。该病又称副结核性肠炎或约內氏病（Johne’s disease）[1]。副结核分枝杆菌可感染牛、羊、鹿等哺乳动物和鸽、斑鸠等鸟类。牛、绵羊、山羊等反刍动物易感，其中集约化养殖的奶牛和肉牛最为易感[2]。本病可通过粪口传播方式由病畜传染给人和其它动物，在我国被列为二类动物疫病[3]。

近年来，我们发现新疆一些牛场存在长期间歇性腹泻、机体逐渐消瘦、反复治疗无明显改善的临床病例，初步怀疑为副结核病病例，采集腹泻粪便样品，进行了实验室相关检测确诊了感染的存在。本文就6例确诊病例的临床症状进行详细描述以供兽医临床诊断时参考。

1 病例基本情况

经萋-尼氏抗酸染色和副结核分枝杆菌特异性基因IS900 PCR扩增[4]检测确诊的6例副结核临床病例均为荷斯坦泌乳期奶牛，无特定发病时间，两年内陆续发病，发病年龄在两岁半至四岁半（30～52月龄）不等，初次发病时体况评分为3.1～3.4[5]，发生腹泻前30 d的日均单产为25～38 kg（因所处泌乳阶段不同，腹泻前日单产量差异较大）。

2 临床症状

发病牛产奶量骤然下降，下降幅度可达30%以上；早、晚体温正常。

腹泻，表现为软便、排泄物稀薄、含有大量气泡、水样便呈喷射状等不一。发病初期呈现间歇性，腹泻2～6 d后停止，间隔5～20 d再次腹泻，期间奶产量无恢复，体温保持正常，精神状态无显著变化。腹泻周期循环2～3次后，奶产量维持在腹泻前的30%～60%，体温正常，随后再次出现腹泻时症状加重，并且腹泻周期缩短，表现频繁腹泻。初次发病3个月后，显现出营养不良，消瘦，被毛杂乱，体况评分2.8～3.1。

3 实验室确诊

3.1 萋-尼氏抗酸染色

采取病牛的粪便，尽量采集含肠黏膜粪便，并采取集菌法处理，具体如下[6,7]：在采集的粪便中加3～5倍量0.5%氢氧化钠搅拌均匀，在55℃水浴中乳化30 min形成均匀的粪便悬浊液，用4层纱布过滤，滤过液在 300×g离心 5 min，取上清液，去掉沉淀物，上清液再以1 700×g离心20 min，弃去上清，用沉淀物涂片，然后萋-尼氏抗酸染色，在油镜下观察可见成簇、团状或丛状红染的细小菌团，菌体呈细短杆状，可初步判定该菌为副结核分枝杆菌。

3.2 分子生物学检测

按照“3.1萋-尼氏抗酸染色”的集菌方法富集细菌，少量生理盐水重悬，调整pH值6.8～7.6，试剂盒提取DNA或者水煮法释放细菌DNA，以Primer90/Primer91（Primer90：5’-GTTCGGGGCCGTCGCTTAGG-3’，Primer91：5’-GAGGTCGATCGCCCACGTGA-3’）为引物对副结核分枝杆菌特异性基因IS900进行PCR 扩增检测，反应程序：94℃ 5 min；94℃ 1 min、58℃ 1 min、72℃ 3 min，30个循环；72℃ 7 min，扩增结果出现约340 bp的片段即确定为副结核分枝杆菌[4,8]。

4 小 结

副结核病的传播速度缓慢，临床上不同病例的出现间隔时间较长，易误判为无关联的或非传染性的内科病。实际上在养殖场该病是一种传播较为缓慢的地方流行性传染病。该病主要感染幼畜，其中1月龄前最易感，最少在感染6个月以后才可能检测到抗副结核分枝杆菌抗体，在2～5岁时部分感染牛才逐步表现出明显的腹泻症状[2]。根据副结核病的疾病发展进程，可分为临床后期（持续大量排菌、腹泻、消瘦、抗体阳性）、临床期（间接性排菌、抗体阳性）、亚临床期（部分牛可检测到排菌和抗体）和隐蔽期（检测不到排菌和抗体）。在副结核病流行的牛群中，这四期感染牛呈现着1：1-2：4-8：10-14的结构比例，表现出典型的“冰山现象”[9,10]。

该病的临床诊断要点是：（1）2岁以上的腹泻牛；（2）持续、顽固性腹泻和慢性进行性消瘦；（3）出现腹泻症状时，体温无明显变化，采食和精神状态基本正常。

临床后期和临床期牛是本病的最主要的传染源，此时，副结核分枝杆菌主要存在于病畜体内肠系膜淋巴结或肠黏膜，通过粪便大量排出，且对外界的抵抗力较强，可存活数月[2]。粪便中存在的副结核分枝杆菌可通过污染饮水、饲草料等方式，经消化道感染健康牛。一旦牛场出现确诊的副结核病临床病例，建议采用副结核分枝杆菌抗体检测试剂盒对8月龄以上的牛进行3～4次/年的全面筛查，通过淘汰阳性牛等全场净化措施控制副结核病的进一步扩散流行。