人HNA-3a基因的克隆及其在HEK-293细胞的表达

陈 丽，周 浩，何宏天，管 政

输血相关急性肺损伤(transfusion-related acute lung injury，TRALI)是临床输血并发的急性呼吸窘迫综合征，一般在输入血液、血浆及相关血制品6 h内发生，是输血相关死亡的首要原因[1-2];目前尚未引起我国广大临床医生和输血医学工作者的重视，临床上无法获得准确的诊断和及时有效的治疗。TRALI的发病机制尚未完全阐明，普遍接受的抗原抗体反应学说认为，人类中性粒细胞抗原(HNA)抗体是导致TRALI的最重要的抗体，其中针对HNA-3a抗原的同种抗体常可引起致命的TRALI[3]。HNA-3a抗原存在于粒细胞、血小板、淋巴细胞、内皮细胞和肾脏、脾脏、胰腺等细胞上。1964年VAN LEEUWAN等[4]在血清学水平鉴定到HNA-3a抗原，2010年HNA-3a抗原的分子基础被阐明，HNA-3a抗原位于胆碱转运样蛋白-2(CTL-2)上。CTL-2蛋白是一种跨膜蛋白，由19号染色体19p13.1区域中的SLC44A2基因编码，其外显子7中的单个核苷酸替换(461G>A；Arg154Gln)导致基因多态性引起HNA-3系统的多样性[5]。因为HNA-3a的免疫原性较强，有妊娠史或输血史的HNA-3b/3b的纯合子个体被免疫产生HNA-3a抗体的可能性较大。目前没有方便快捷检测人群中HNA-3a抗体发生频率的实验方法，本课题克隆了人HNA-3a基因，并构建pEGFPN3-HNA-3a真核表达载体，在HEK-293细胞中进行瞬时表达和鉴定，为今后运用HNA-3a抗原检测HNA-3a抗体打下实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料 HEK-293细胞和 DH5α菌为蚌埠医学院病理生理实验室保存。高糖DMEM(美国Gibico公司)；胎牛血清(杭州四季青)；Trizol试剂(美国Gibico公司)；PBS缓冲液(美国Solarbio公司)；CO2恒温培养箱(美国Thermo Fisher Scientific公司)；真核表达载体 pEGFP-N3、限制性内切酶HindⅢ和Kpn均购自上海吉凯基因化学技术有限公司。T4连接酶、PfuDNA聚合酶和逆转录试剂盒均购自 Promega公司。质粒纯化试剂盒及胶回收试剂盒为上海华舜生物公司产品。LipofectamineTM2000转染试剂盒为美国 Invitrogen 公司产品。鼠单克隆抗体Flag(M2-3165)购自Sigma-Aldrich公司。抗GADPH抗体购自天津三箭公司。HRP二抗购自Santa Cruz。

1.2 方法

1.2.1 人HNA-3a cDNA合成和RT-PCR GeneBank调取表达HNA-3a抗原的纯合子的CDS基因序列(SLC44A2)，利用Vector NTI设计引物。用Trizol试剂抽提HNA-3a纯合子个体RNA并逆转录为cDNA，以该cDNA为模板进行PCR扩增。上游引物：5′-TTT GTT AGA CGA AGC TTG GGC TGC AGG TCG ACT CTA GAG GAT CCC CGG GTA CCG GTC GCC ACC-3′，在5′端引入XhoⅠ的酶切位点；下游引物：5′-CCG GTC GCC ACC ATG GTG AGC AAG GG-3′，在5′端引入KpnⅠ的酶切位点；反应条件：98 ℃预变性5 min，98 ℃变性10 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸90 s，共30个循环，最后于72 ℃延伸8 min。将RT-PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察结果。

1.2.2 人HNA-3a基因真核表达质粒的构建和鉴定 PCR产物经胶回收纯化后与pEGFP-N3载体分别以XhoⅠ、KpnⅠ进行双酶切。将酶切后的目的基因与载体经T4 DNA连接酶于4 ℃连接过夜，并转化DH5a菌。挑取阳性克隆经振荡培养后提取质粒，以XhoⅠ和KpnⅠ双酶切鉴定，酶切鉴定符合的克隆送上海吉凯公司进一步测序鉴定。

1.2.3 质粒转染HEK-293细胞及稳转细胞株的筛选 HEK-293细胞置于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，于37 ℃、5%CO2常规培养。融合取对数生长期细胞按5×105/孔接种至6孔板，每孔加入2 mL DMEM，待细胞增殖融合达80%面积时进行转染。转染前更换Opti-MEM无血清培养基，转染的步骤及方法参照LipofectamineTM2000试剂说明书，同时转染pEGFP-N3空载体作为阴性对照，转染48 h后观察转染效率。按文献[6]报道方法，用0.6 μm/mL G418培养基筛选阳性转染细胞。筛选2.5周后接种24孔板，连续稀释、挑选单克隆细胞扩增。筛选出的目的基因稳转株置于显微镜下，蓝光激发，观察绿色荧光蛋白表达情况。

1.2.4 Western blotting检测转染后细胞中HNA-3a蛋白的表达 质粒转染后第3天收集培养板中的细胞，用1% NP-40裂解缓冲液裂解并提取蛋白。利用BSA标准品绘制标准曲线后算得待测品蛋白浓度。配制浓度为10%的分离胶，将细胞裂解液进行SDS-PAGE电泳。电泳结束后进行转膜，将蛋白条带电转至PVDF膜上。用5%脱脂牛奶封闭并室温孵育1 h，减少非特异性结合后，按1∶1 000的比例稀释的鼠单克隆抗体Flag (C端融合Flag标签)4 ℃孵育过夜。次日，用0.1%的PBST洗膜3次后，加入1∶5 000倍稀释的二抗，室温孵育1 h。洗膜3次后加显影液，观测蛋白条带。

2 结果

2.1 人HNA-3a cDNA的RT-PCR扩增 人HNA-3a基因的PCR扩增产物的凝胶电泳结果见图1，在2 167 bp处出现一条明亮的条带，与预期的目的基因大小相符。

2.2 pEGFP-N3-HNA-3a表达质粒的构建和鉴定 PCR扩增后的片段经XhoⅠ、KpnⅠ双酶切后，克隆到同样经XhoⅠ、KpnⅠ双酶切的真核表达质粒pEGFP-N3中。转化感受态细胞后筛选出对相应抗生素具有抗性的阳性克隆，制备少量的质粒，用XhoⅠ和KpnⅠ双酶切鉴定重组质粒，可切出约986 bp大小的片段，同预期的结果一致(见图2)。阳性克隆测序结果经比对，序列完全正确，说明HNA-3a基因已成功克隆至pEGFP-N3载体中。

2.3 pEGFP-N3-HNA-3质粒在HEK-293T细胞中的表达与鉴定 将pEGFP-N3-HNA-3a重组质粒和pEGFP-N3空载体分别转染到HEK-293T细胞中，转染后24 h即可在荧光显微镜下观察到转染细胞中GFP荧光的表达，但表达量较少，GFP的表达量随着时间的延长逐渐增加，至72 h最强(见图3)。Western blotting检测表明，稳转细胞株HNA-3a蛋白水平有表达，而未转染及转染空载体的细胞上HNA-3a不表达(见图4)。

3 讨论

目前，TRALI仍然是输血相关死亡的首要原因[1-2]。据美国FDA统计显示，在2011-2015年，每年TRALI死亡病例数占输血相关死亡人数的38%[7]。在已知的TRALI的发病案例中，HNA-3a抗体是导致致死性TRALI的主要原因。HNA-3a抗原的免疫原性较强，一般由输血或妊娠产生。因此，采供血机构应对有妊娠史或输血史的供者血浆进行HNA-3a抗体的筛查，以减少或避免TRALI的发生。可是由于我国国情的限制，并未像欧美等一些发达国家一样禁止使用有妊娠史或输血史的供血者血浆，同时由于种种原因我们目前不仅不了解HNA-3a抗体在特定人群中的发生频率，更没有开展HNA-3a的筛查工作，这就可能大大增加了TRALI发生的概率。

迄今HNA-3a抗体的检测没有商业化的抗原可供使用，用细菌表达出的可溶性肽类运在ELISA方法中并不能检测出目标抗体，这可能与抗原表达中的转录后糖基化修饰有关[8-9]。目前，国际上通用的检测HNA抗体的方法是ISBT工作组推荐的两种经典实验方法，分别是中性粒细胞聚集实验(GAT)和中性粒细胞免疫荧光实验(GIFT)。不过这两种实验在检测过程中需要从确定HNA基因型的志愿者中分离出新鲜的粒细胞，既艰苦又耗时，不适用于常规的筛选工作[10]。因此，研究出一种更加简便、快速的HNA-3a抗体检测方法对预防TRALI具有重要的现实意义。

BAYAT等[11]在研究中分别构建了含不同长度HNA-3基因外显子的表达载体，结果显示缩短的外显子构建的载体表达的蛋白不识别HNA-3a的特异性，只有全长外显子序列表达的抗原的免疫原性才能识别所有抗体。另WOZNIAK等[6]也证实了这一研究，并且在SLC44A2全长序列的153、154、301位置必须为精氨酸、亮氨酸、苏氨酸，这样表达的蛋白才具有HNA-3a的抗原性。因此，本研究将153、154、301位置分别突变为精氨酸、亮氨酸、苏氨酸的SLC44A2基因全长编码序列克隆到了pEGFP-N3真核表达载体中，并转染到HEK293细胞中。G418筛选出稳定转染的细胞株，转染后细胞的HNA-3a免疫印迹结果和绿色荧光均证实了HNA-3a在HEK293细胞中得到了稳定有效的表达，表明了我们成功地构建了能够稳定高效表达HNA-3a的稳转细胞株,这为我们下一步研究检测血浆中的HNA-3a抗体的方法打下了实验基础，从而为开展人群中HNA-3a抗体筛检工作提供技术上支持。