褪黑素及其信号传导通路与青少年特发性脊柱侧凸的相关性研究进展

杨依林 倪海键

摘 要 青少年特发性脊柱侧凸（adolescent idiopathic scoliosis，AIS）是一种原因不明的发生于青春期的结构性脊柱侧凸，病因涉及遗传、激素、生物力学、神经内分泌等，其中褪黑素与AIS的相关性研究一直受到广泛关注。近年来，多项研究表明AIS发生、发展可能并非由于单纯的褪黑素水平降低所致，而是有可能存在褪黑素下游信号通路缺陷。随着分子生物学技术的发展，这一相关性的研究已经深入到分子水平。全文综述褪黑素及其信号传导通路在AIS发病机制中作用的研究进展，为进一步研究AIS的发病机制提供参考。

关键词 脊柱侧凸；褪黑素；信号传导通路；发病机制

中图分类号：R682.3 文献标志码：A 文章编号：1006-1533（2019）02-0003-04

Research progress in the correlation between melatonin and its signal transduction pathway and adolescent idiopathic scoliosis

YANG Yilin1， NI Haijian2

（1.Spine Surgery of Changhai Hospital Affiliated to Naval Medical University， Shanghai 200433， China； 2. Spine Surgery of the Tenth Peoples Hospital Affiliated to Tongji University， Shanghai 200072， China）

ABSTRACT Adolescent idiopathic scoliosis（AIS） is an unexplained structural scoliosis in adolescence. The etiology involves heredity， hormone， biomechanicals， neuroendocrine and other aspects. The relationship between melatonin and AIS has been widely concerned. In recent years， many studies have shown that the occurrence and development of AIS may not be simply due to the decrease of melatonin levels， but to the defects in the downstream signaling pathway of melatonin. With the development of molecular biology techniques， the correlation studies have penetrated to the molecular level. This article reviews the research progress of melatonin and its signal transduction pathway in the pathogenesis of AIS for providing a reference for further study on the pathogenesis of AIS.

KEY WORDS scoliosis； melatonin； signal transduction pathway； pathogenesis

青少年特發性脊柱侧凸（adolescent idiopathic scoliosis，AIS）是一种复杂的脊柱三维畸形，最常见于10～16岁的青少年，女性居多，发病率为2.0%～13.6%[1]，其病因尚未完全明晰。有诸多因素可能与AIS的发病相关，包括遗传、激素、生物力学、神经内分泌等。其中褪黑素与AIS的相关性研究一直受到广泛关注，尤其是近年来随着分子生物学技术的发展，这一相关性研究已经深入到分子水平。现将褪黑素及其信号传导通路与AIS相关性研究进展作一综述。

1 褪黑素与褪黑素受体

褪黑素在人体内主要由松果体和部分视网膜合成，化学成分为N-乙酰-5-甲氧色胺。昼夜光线的转换通过视网膜感受器经下丘脑视上核及交感神经系统上传至松果体调控褪黑素的合成和分泌[2]，由此形成了褪黑素分泌的生物节律，即黑夜时分泌增加，凌晨2～4时达高峰后逐渐下降[3-4]。在不同年龄人群中，褪黑素的血清浓度也存在差异，婴儿3月龄前褪黑素分泌极少，1～3岁时达夜间分泌高峰，以后每10年峰值减少10%～15%[5-6]。褪黑素除参与调节生物节律外，还广泛参与胚胎发育、生殖、免疫及骨骼的生长发育等过程。

褪黑素具有特异性的膜结合蛋白，即褪黑素特异性膜受体，属于G蛋白偶联受体超家族，通过与Gi/Gs蛋白偶联介导褪黑素的生物学功能。人的褪黑素受体主要分布于中枢神经系统、肠道、卵巢、血液和骨骼系统。根据与褪黑素亲和力的不同可分为ML1（高亲和力）受体和ML2（低亲和力）受体[7-8]。ML1受体在人下丘脑视上核分布密度最高，与褪黑素结合后作为生物节律起搏器周期性地抑制神经活动而产生生物钟效应[9]；而ML2受体是一种醌还原酶，对其的针对性研究较少，与褪黑素结合后的生物效应尚不清楚[10]。随着PCR技术的应用，高亲和力的ML1受体的两种亚型MT1和MT2受体的DNA序列先后被克隆[10-11]，其中MT1受体主要分布于中枢神经系统，能够激活蛋白激酶C，而MT2受体则主要分布于周围组织，可以在抑制可溶性鸟苷酸环化酶通路的同时促进蛋白激酶C的活性。褪黑素的主要生物学效应均由褪黑素与MT1或MT2受体的特异性结合并通过其下游信号传导通路介导。此外，有研究发现褪黑素还可以与细胞内的钙调蛋白结合，通过腺苷酸环化酶或其他结构蛋白调节钙调蛋白信号通路，从而参与包括钙离子转运在内的多种功能[12]。

2 褪黑素与AIS

褪黑素与AIS的相关性研究一直是AIS病因学研究的热点。1983年，Dubousset等[13]通过实验证实，切除雏鸡的松果体可以导致脊柱侧凸的发生。后续研究证实，这一方法所产生的侧凸形状、顶椎旋转、肋骨突起以及体感诱发电位（SEPs）的模式都与人的AIS极为相似[14-15]。由于褪黑素是松果体分泌的最主要激素，因此研究人员认为侧凸的发生与血清褪黑素水平的降低有关。Machida等[16]进一步将孵化3 d的90只雏鸡切除松果体后随机分为三组，分别给予腹腔内注射褪黑素、5-羟色胺（褪黑素前体）和空白处置，3周后空白组100%发生脊柱侧凸，5-羟色胺组和褪黑素组的发生率则分别为 73%和20%，且褪黑素组发生侧凸的6只雏鸡的侧凸角度明显小于其他两组。此外，这一侧凸模型还在切除松果体的鲑鱼[17]、双足大鼠[18]以及有褪黑素合成缺陷的C57BL/6J双足小鼠[19]中成功复制。Machida等[20]还对AIS临床患者进行研究，发现进展型的AIS患者血清褪黑素水平比稳定型患者及正常对照者低，进一步推测血清褪黑素水平降低与AIS的发病相关。后续研究对这一推论存在一定的争议：①不同于Machida等[16]的研究结果，在其他复制切除松果体鸡侧凸模型的实验中，侧凸的发生率存在较大差异[21-22]；②补充外源性褪黑素似乎并不一定能阻止侧凸发生[23-24]；③多数研究报道AIS患者血清褪黑素水平与正常对照者无明显差异[14，25]，提示褪黑素参与AIS的发病并非简单地源于褪黑素水平的降低，而是有可能存在更为复杂的机制。

3 褪黑素信号通路在AIS发病机制中的作用

近年来，众多研究者将褪黑素与AIS发病相关性的研究目标从褪黑素本身转向了特异性受体介导的褪黑素信号传导通路。在正常细胞中，福斯可林（forskolin）能刺激G蛋白进而活化腺苷酸环化酶，导致细胞内环磷酸腺苷（cAMP）浓度增加，而外源性褪黑素刺激则会抑制这一反应性cAMP浓度增加[26]。现有研究表明，褪黑素及其信号通路在骨代谢调控方面发挥重要作用，能够促进成骨细胞分化和基质矿化，并且在一定浓度范围内可显著提高人类骨细胞及成骨细胞系增殖（分别提高215%和193%）[27-28]。Moreau等[29]的研究首先发现，在体外培养的AIS患者的成骨细胞中，褪黑素并不能抑制福斯可林诱导的细胞内cAMP的增加，提示AIS患者存在褪黑素信号传导通路异常。Azeddine等[30]的进一步研究发现，在体外培养的AIS患者的成骨细胞中，与褪黑素特异性膜受体偶联的G抑制蛋白（Gi）存在丝氨酸残基的异常磷酸化，推测这一异常有可能导致了下游信号传导通路异常，进而引起最终的褪黑素效应异常。Akoume等[31]通过更为快速、精确的细胞介电谱学分析AIS患者外周血单核细胞内的G蛋白功能，发现同样存在类似AIS成骨细胞内的褪黑素受体G蛋白偶联及cAMP的效应异常。由于外周血易于获得、检测方便，因此，笔者认为这一方法可以用于AIS患者的早期筛查，当然，其敏感性和精确性还有待高等级循证医学研究进一步证实。

除此之外，有诸多研究提示AIS患者褪黑素信号通路异常有可能源于褪黑素受体的表达缺陷。Qiu等[32-33]通过大样本的病例对照分析研究AIS患者褪黑素受体的基因多态性，发现編码MT2受体的MTNR1B基因启动子区域的基因多态性与AIS易感性显著相关，而编码MT1受体的MTNR1A基因多态性与AIS易感性无显著相关。随后，Man等[34]将AIS患者和正常对照者的成骨细胞进行体外培养，在给予相同浓度的褪黑素刺激后，发现AIS患者成骨细胞的增值率明显低于对照组；在对照组中加入MT2受体特异性拮抗剂4-P-PDOT后，对照组的细胞增殖效应被抑制，提示褪黑素对成骨细胞的增殖效应是由MT2受体介导，而AIS患者的成骨细胞有可能存在MT2受体或其下游信号通路缺陷，从而影响了成骨细胞的增殖分化。Man等[35]和Yin等[36]进一步对成骨细胞的MT1、MT2受体进行mRNA和蛋白表达检测，发现AIS患者成骨细胞MT2受体的mRNA和蛋白表达显著低于对照组。而Wang等[37]发现在AIS患者生长板软骨细胞中，同样存在MT2受体的表达缺陷，并出现褪黑素诱导的细胞增殖和胶原及碱性磷酸酶的表达降低。Chen等[38]将AIS患者及正常对照者的骨髓间充质干细胞（hMSCs）进行体外培养，发现AIS患者的hMSCs也存在MT2受体的低表达，并且在成骨及成软骨培养环境中对褪黑素的刺激不敏感。上述研究提示，MT2受体的表达缺陷有可能导致AIS患者成骨细胞和软骨细胞中褪黑素信号传导通路缺陷，进而导致AIS患者的骨骼发育异常，并最终参与了AIS的发病。进一步对AIS患者成骨细胞和软骨细胞中褪黑素MT2受体-cAMP介导的信号传导通路进行深入研究，将有助于揭示褪黑素及其信号通路异常参与AIS发病的机制。

4 展望

新的分子生物学技术如基因芯片、蛋白质芯片等的发展，将能更准确地对褪黑素信号传导通路中的蛋白进行功能定位，从而有助于进一步分析AIS患者褪黑素信号传导通路的下游效应蛋白的变化，使AIS的分子诊断及精确靶点治疗成为可能。同时，“神经-骨代谢学”这一新的交叉学科的兴起[39]，将有助于进一步揭示神经系统及神经内分泌系统通过中枢及外周等不同途径对骨与软骨代谢的调控机制，从而有望更全面、更系统地描绘出褪黑素及其信号传导通路参与AIS发病机制的全景图。

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