拟南芥中高效创制不携带转基因元件多重突变体的CRISPR/Cas9 基因编辑系统

在植物基因编辑的过程中去除CRISPR/Cas9 表达元件非常重要，因为CRISPR/Cas9 表达元件在植物中的存在会带来多方面的问题：（1）取部分组织进行基因型检测时很难区分突变是遗传自上一代还是当代新产生的（当代新产生的体细胞突变可能不能遗传）；（2）CRISPR/Cas9 元件的持续存在既增加了脱靶的风险，又不利于开展后续的互补实验；（3）携带CRISPR/Cas9元件的植物属于转基因植物，获得商业应用的难度大大增加。

近日，北京大学现代农学院与生命科学学院陈浩东研究组在aBIOTECH 期刊发表了题为“A novel CRISPR/Cas9 system for efficiently generating Cas9-free multiplex mutants inArabidopsis”的研究论文，报道了一种高效地在拟南芥中创制多基因编辑的不携带转基因元件（Cas9-free）植株的方法，该方法也可能在其他植物中类似应用。

研究者构建了Cas9-P2A-GFP 融合蛋白，其中P2A 是可以发生自我断裂的小肽，这样GFP 不影响Cas9 的核酸内切酶活性。结合同尾酶介导的串联多个sgRNA 的技术，该系统可实现多基因编辑。因GFP 与Cas9 的等量表达，通过观测GFP 的荧光，即可获得Cas9 蛋白的存在与否及含量高低的信息，而Cas9 蛋白的含量高低与基因编辑的效率具有很好的正相关性。由此，使用者在T1 代中挑选GFP 荧光强的植株，这些植株有很高的概率发生基因编辑，对目标序列鉴定确认发生编辑后，收集这些植株的T2 代种子；在T2 植株中挑选没有GFP 表达的植株，即为目标Cas9-free 植株。因 T1 代荧光弱的植株可直接舍弃，T2 代直接挑选无荧光的植株，大大减少了基因型鉴定的工作量，提高了研究效率。