质外体蛋白质在植物重金属耐性中的作用

芮海云, 刘清泉, 沈振国

(1. 泰州学院 医药与化学化工学院, 泰州 225300； 2. 江苏省中国科学院植物研究所 观赏植物研究中心， 南京 210024； 3. 南京农业大学 生命科学学院， 南京 210095)

农业土壤的重金属污染已成为严重的环境问题，不仅直接影响植物的生长发育、农产品的品质，还通过食物链危及人类的健康。因此，重金属对农业土壤的污染及其在土壤-植物系统中的迁移成为当今普遍关注的全球环境问题，植物重金属耐性的机理也逐渐成为研究的热点之一。植物在长期进化过程中，形成了一系列对重金属毒害的适应性机制，主要包括排斥和积累两个机制。在排斥机制中，植物限制根系对重金属离子的吸收和从根系向地上部的运输，或主动向细胞外运输有毒离子，在这方面根质外体、根系分泌物和菌根可能起着重要作用；而在积累机制中，植物把重金属分布在特定的器官、组织或细胞器，以低生物活性的解毒形态存在。

近年来的研究表明，质外体不仅是一个结构性的被动防御屏障，更是一个动态性的主动防御体系，在植物抵抗重金属胁迫中具有重要作用。质外体由细胞壁、细胞间隙、胞间层和导管的空腔组成，其中的液体被称为质外体汁液。细胞壁包括初生壁和次生壁，相邻细胞初生壁间有胞间层。初生壁主要由蛋白质和多糖(包括纤维素、半纤维素和果胶)组成，次生壁除同样含纤维素和半纤维素外，大部分为木质素。蛋白质约占质外体所有成分的5%～10%。质外体汁液中的蛋白质与细胞壁几乎没有相互作用，在质外体空间自由移动。细胞壁中的蛋白质，一类通过范德华力、氢键、亲水或离子键与细胞壁基质松散结合；另一类是细胞壁结构蛋白，通过共价键与细胞壁骨架结合，富含羟脯氨酸、脯氨酸和甘氨酸。由于早期人们对质外体蛋白质作用的忽视，加之其提取远较胞内蛋白质困难，因此质外体蛋白质的研究落后于胞内蛋白质。近年来，随着植物质外体蛋白质组学的发展, 越来越多的质外体蛋白质被鉴定出来, 为研究质外体蛋白质的功能奠定了良好的基础。目前约500种拟南芥(Arabidopsisthaliana)质外体蛋白质已被鉴定；其次为水稻(Oryzasativa)，有314种质外体蛋白质被鉴定；关于鹰嘴豆(Cicerarietinum)、大豆(Glycinemax)、向日葵(Helianthusannuus)、烟草(Nicotianatabacum)、苜蓿(Medicagosativa)、马铃薯(Solanumtuberosum)和玉米(Zeamays)等植物的质外体蛋白质分析也已见报道[2]。这些质外体蛋白质的功能主要有：1)参与多糖代谢，如糖苷水解酶和糖酯酶等；2)参与胁迫响应，如类萌发素蛋白、索马甜蛋白和几丁质酶等；3)参与蛋白质代谢，如蛋白酶、蛋白酶抑制剂等；4)参与氧化还原反应，如过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)等；5)参与信号转导，如蛋白激酶等[1-2]。

大量研究表明，作为金属离子跨膜进入细胞质的第一道屏障，植物细胞壁对于重金属离子进入细胞起很好的屏障作用。植物细胞通过影响细胞壁中多糖、蛋白质和木质素等成分的生物合成，可以改变其结合重金属离子的能力，或改变重金属的运输与分配以及植物的生长发育，从而影响植物对重金属的耐性[3]。质外体蛋白质参与植物细胞壁的重构[4]，在植物对重金属的耐性中发挥重要作用。本文主要介绍质外体蛋白质在植物抗重金属胁迫方面的研究进展。

1 细胞壁结构蛋白在植物重金属耐性中的作用

植物细胞壁中主要的结构蛋白包括富含脯氨酸的蛋白 (PRPs)、富含甘氨酸的蛋白 (GRPs)和富含羟脯氨酸糖蛋白(HRGP)家族。HRGP家族主要包括伸展蛋白、富含脯氨酸/羟脯氨酸糖蛋白、茄科凝集素和阿拉伯半乳糖蛋白(AGPs)。细胞壁结构蛋白通过共价键与细胞壁多糖交联，这一交联是一个动态变化的过程，可以影响细胞壁的强度和抗降解能力，在植物生长发育和对生物、非生物胁迫的响应过程中发挥重要作用[5]，同时植物细胞壁结构蛋白的结构和含量也可以影响其结合重金属离子的能力。Pan等[6]研究发现，铝能显著诱导水稻根尖细胞壁HRGP含量升高，减轻铝的毒害，且铝耐性品种较铝敏感品种显著。Chandran 等[7]报道铝胁迫能诱导蒺藜苜蓿AGP基因的表达，铝敏感品种较铝耐性品种显著。细胞壁扩展蛋白调节细胞壁的松弛和伸展，Pena等[8]研究发现铜胁迫下小麦主根细胞壁扩展蛋白基因上调表达。在铅胁迫下，大蒜根细胞壁富含半胱氨酸蛋白含量增加，和Pb2+相互作用，将Pb2+固定在根细胞壁中[9]。

2 质外体多糖代谢蛋白在植物重金属耐性中的作用

参与多糖代谢的蛋白质是主要的质外体蛋白质，其中糖苷水解酶(GHs)和糖酯酶(CEs)在生物和非生物胁迫下变化显著，说明细胞壁发生的改变主要是多糖的断裂和修饰[5]。

质外体多糖代谢包括多糖的转糖苷基、交联、水解、转乙酰基、氧化和乙酰化等[1]。木葡聚糖是双子叶植物初生细胞壁中最主要的半纤维素，木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶(XTH)属于GH家族，是一类催化木葡聚糖分子转移或水解的酶，它能够内切木葡聚糖聚合体，将产生的还原性末端连接到另外一个木葡聚糖链或水分子上，使连接纤维素微纤丝间的木葡聚糖链解聚，细胞壁膨胀疏松，促进细胞的生长。Zhu等[10]研究发现, 拟南芥XTH基因T-DNA插入突变体XTH31，根系细胞壁中木葡聚糖含量减少，降低了对铝的结合力，因此对铝的耐性高于野生型。 Yang等[11]研究发现，铝处理能显著抑制拟南芥根尖细胞木葡聚糖内转糖苷酶的活性，使木葡聚糖链解聚困难，细胞壁无法松弛，细胞伸长受到抑制。

作用于果胶的CEs也是在生物和非生物胁迫下变化显著的质外体蛋白质。果胶主要由半乳糖醛酸聚糖、鼠李半乳糖醛酸聚糖Ⅰ(RG-Ⅰ)和鼠李半乳糖醛酸聚糖Ⅱ(RG-Ⅱ)构成，半乳糖醛酸聚糖是半乳糖醛酸通过Ca2+交联的聚合体，RG-Ⅰ和RG-Ⅱ由半乳糖醛酸和鼠李糖构成的主链和各自特有的支链糖基构成。果胶甲酯酶(PME)负责细胞壁中果胶的脱甲基化，使果胶带有更多的自由羧基，提高了其结合重金属的能力。Paynel等[12]研究发现，镉处理能诱导亚麻PME活性增加。东南景天镉超积累生态型根中PME的活性低于非超积累生态型，根中有更多的甲基酯化的果胶, 因此根部较非超积累生态型驻留较少的镉，更多的镉转运至地上部[13]。 此外，Chen等[14]报道，过表达MAN3基因导致拟南芥甘露聚糖酶活性升高，细胞壁中甘露糖含量增加，因此拟南芥的镉积累和镉耐性增加。

3 质外体氧化还原蛋白在植物重金属耐性中的作用

质外体氧化还原蛋白调节质外体氧化还原状态，影响细胞壁木质素和多糖的组成，影响植物对重金属的耐性[15]。

许多研究结果显示，重金属诱导活性氧(ROS)在植物根系和叶片质外体中的积累，诱导酶和非酶抗氧化系统的响应。我们的研究结果显示[16]，镉诱导H2O2在植物根质外体中的积累，质外体H2O2的增加伴随着质外体烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-过氧化物酶(NADH-POD)活性的升高，推测NADH-POD是质外体H2O2的来源之一。Zhang等[17]报道镉胁迫下箭舌豌豆叶质外体汁液中含有较高的抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性，根质外体汁液中含有较高的SOD活性。过表达SOD和APX的转基因拟南芥中，H2O2的积累激活许多木质素合成基因和转录因子的上调表达[18]。

木质素合成反应是植物应对胁迫的典型防御反应。镉胁迫导致各种植物木质素含量的增加，过量的铜也能导致植物组织中木质素的积累，Cheng 等[19]报道，铜能通过促进Bruguieragymnorrhiza和Rhizophorastylosa的木质化，抑制其生长，降低根的渗透性。我们的研究也发现，铜刺激水稻根系的木质化，抑制根的伸长[20]。有假说认为，木质素在根系内皮层细胞壁中的沉积可以抑制金属元素进入木质部或从维管束向外的运输，根系木质部的木质化可以抑制重金属向地上部的转运。木质素主要由酚类化合物p-香豆醇、松柏醇和芥子醇聚合而成，木质素单体在细胞质内合成后被运送至质外体，最后在依赖H2O2的POD和依赖O2的漆酶(LAC)的催化下，聚合成为高分子木质素。

参与木质素氧化聚合的主要是第III类POD，存在于质外体，包括可溶态POD(SPOD)和细胞壁离子结合态(IPOD)。已有实验结果显示，POD基因表达的下调会导致植物木质素含量的降低及组成的改变，POD基因swpa4的过表达增加植物酚和木质素的含量[21]。蛋白质组学分析显示，豇豆在高浓度锰胁迫下, 叶片质外体可溶性蛋白的浓度升高，其中一些酸性POD丰度显著增加[22]。POD还氧化阿魏酸多糖和结构蛋白，导致高度复杂的大分子的形成，因而增加细胞和植物的结构强度[23]。在铜处理的Lygodiumjaponicum(Thunb.) Sw.中，富含糖醛酸的果胶聚合物和其他的细胞壁组分高度结合，这一过程也是在POD的催化下完成的[24]。

植物LAC被认为和POD一起参与木质素单体聚合的过程。有研究发现，转陆地棉漆酶基因LAC1的杨树茎的木质素含量高于野生型[25]。Berthet 等[26]对拟南芥lac4和lac17双基因敲除突变体的研究发现，双突变体茎中木质素含量比野生型低40%，并且在持续光照条件下，双突变体植株出现矮化现象。拟南芥漆酶LAC11也被证明参与木质素单体的聚合过程，研究发现LAC4、LAC11 和LAC17 3基因敲除突变体中木质素积累几乎完全得到抑制，植株生长严重受阻[27]。在拟南芥漆酶基因lac17 突变体中表达甘蔗漆酶基因SofLAC，能够恢复突变体植株木质素含量，使其达到野生型水平，表明SofLAC参与甘蔗的木质化过程[28]。欧洲大叶杨Ptr-miR397a 能够通过调控漆酶基因的表达改变木质素的含量[29]。Bhuiyan 等[30]研究发现，在镉处理下大豆根生长受到抑制，根木质素含量增加，并伴随着POD和LAC活性的增加。我们通过漆酶基因(OsLAC10)过表达拟南芥株系的研究发现，漆酶促进木质素的合成，减少根系对铜的吸收，增强植株对铜的耐性[20,31]。

4 质外体胁迫响应蛋白在植物重金属耐性中的作用

胁迫响应蛋白通过诱导植物的一般胁迫响应过程，影响植物对重金属胁迫的耐性。植物胁迫响应蛋白中最丰富的是病程相关蛋白(PR)，包括几丁质酶、1,3-葡糖苷酶、索马甜蛋白和类萌发素蛋白等。几丁质酶和1,3-葡糖苷酶都是糖苷水解酶，索马甜蛋白能破坏细胞膜或水解细胞壁多糖的1,3-糖苷键。蛋白质组学研究显示，75 μmol/L铝处理3天，水稻叶中几丁质酶丰度上调2.9倍[32]。豇豆在高浓度锰胁迫下, 叶质外体汁液中葡糖苷酶、几丁质酶和类索马甜蛋白的丰度增加[22]。镉胁迫下，玉米(ZeamaysL.cv. Quintal)和大豆(GlycinemaxL. cv. Korada)细胞壁β-1,3-葡聚糖酶同工酶活性增加[33]。类萌发素蛋白(GLPs)是植物质外体中普遍存在的与小麦萌发素序列高度相似的可溶性糖蛋白，在植物不同生长生育阶段及不同的生物与非生物胁迫条件下表现出不同的生物学功能，是一类极其重要的胁迫响应蛋白。已有研究结果显示，GLPs主要以酶、受体和结构蛋白的形式参与多种生理生化过程，酶包括超氧物歧化酶(SOD)、草酸氧化酶(OXO)、多酚氧化酶(PPOs)和ADP葡萄糖焦磷酸酶、磷酸二酯酶[34]。草酸氧化酶催化草酸降解成H2O2和CO2，最近Sakamoto等[35]利用体外和体内实验证实了杜鹃花RmGLP2具有草酸氧化酶(OXO)活性，转RmGLP2烟草细胞草酸含量降低。SOD和OXO的共同作用是产生H2O2，因此GLPs在质外体的存在，可能参与质外体 H2O2的形成，进而通过细胞壁蛋白质和多糖的交联起到强化细胞壁的作用。Rietz 等[36]报道BnGLP3和BnGLP12诱导参与的氧化迸发在油菜抗真菌病害中起了重要作用。向日葵HaGLP1在拟南芥中的表达促进ROS积累和提高植株抗真菌病的能力[37]。Banerjee 等[38]报道过表达OsGLP1的烟草超量积累H2O2，并引起细胞壁组分的交联，加固细胞壁结构。Davidson等[39]报道水稻的12个GLPs均定位在细胞壁中，病原菌浸染时，细胞壁迅速发生交联作用以保护水稻叶片免受伤害。蛋白质组学分析显示GLP(草酸氧化酶活性)在铝处理的番茄根中被抑制[40]，转录组学研究也发现重金属胁迫下水稻根GLP基因差异表达[41]，显示GLP在植物重金属耐性中发挥作用。

5 小结与展望

近年来的研究表明，质外体蛋白质在植物重金属耐性中具有重要作用，然而质外体蛋白质如何影响质外体氧化还原稳态，参与质外体成分的组织和重建，从而影响植物对重金属的耐性？其机理尚不清楚[42]。目前关于质外体蛋白质在植物重金属耐性中作用的研究大多集中在生理生化水平，且是对少数质外体蛋白质的研究。随着蛋白质组学、转录组学等技术的应用，可望在整体水平上对质外体蛋白质在植物重金属耐性中作用的分子机制进行深入研究。可围绕重金属胁迫下植物质外体蛋白质的差异表达和修饰；质外体蛋白质相关基因的表达调控；质外体蛋白质表达变化与质外体氧化还原稳态、质外体组成改变的关系等进行研究，以阐明质外体蛋白质在植物重金属耐性中的作用及其分子机制。这不仅具有重要的理论意义，而且还可以通过分子遗传学技术调控质外体组分的生物合成，改变重金属在植物体内的积累和分配，特别是为降低重金属在植物可食部分中的积累，保证农产品安全，提供新的技术途径。