椴树蜜中多酚类成分的鉴定

蔺 怡，赵宏玉，张红城，江利华

（1.河北工程大学生命科学与食品工程学院，河北邯郸 056000；2.北京市食品安全监控和风险评估中心，北京 100093；3.中国农业科学院蜜蜂研究所，北京 100093）

蜂蜜，又称为“石蜜”“岩蜜”，最早被记载于《神农本草经》[1]。蜂蜜是一种天然甜味物质，通过蜜蜂采集植物的花蜜或蜜露等其他甜味分泌物混以自身唾液腺的分泌物，经体内酶或其他特殊物质加工之后酿造而成，是最古老和使用最广泛的食品之一[2-5]。已有报道指出，蜂蜜不仅富含葡萄糖、果糖，还含有少量蛋白质、维生素、矿物质、有机酸，以及多酚类化合物等超过200多种物质，具有抗氧化、抗衰老、抑菌消炎、补血润肺、调节胃肠道、增强免疫力等多种生物活性[6-10]。因此，蜂蜜被广泛认为是营养价值高、生物活性广的天然保健品[11-12]。

我国地域广阔、蜜源植物多种多样，椴树作为我国东北地区重要的蜜源植物之一，为我国蜂蜜产业的发展起到至关重要的作用[13]。椴树蜜主要以椴树科中紫椴和糠椴为蜜源植物，因而椴树蜜又可分为紫椴蜜和糠椴蜜，是我国实行等级划分后唯一确定过的特等蜂蜜[14]。一般可观察到，紫椴树花朵面朝上，颜色呈浅琥珀色；糠椴树花朵面朝下，颜色呈特浅琥珀色[15]。椴树蜜具有浓郁的香味、易结晶，且结晶后紫椴蜜变为雪白色，糠椴蜜的颜色则偏黄一些[16-17]。以往研究表明，多酚类化合物可作为判别蜂蜜植物来源的内在标志之一，同时也是构成蜂蜜生物活性作用的重要成分之一[18]。

近年来，关于椴树蜜中的多酚类成分的研究不断增加。例如，Trutvetter S等人[19]采用超高效液相色谱联用四极杆飞行时间质谱的方法测定不同蜂蜜样品中酚酸和黄酮类化合物，证实了椴树蜜中存在大量的脱落酸。Bertoncelj J等人[20]通过固相萃取法分别对7种斯洛文尼亚蜂蜜中的黄酮类化合物提取，再结合液相色谱-二极管阵列检测法和电喷雾电离质谱法，在椴树蜜中鉴定出木犀草素、槲皮素、柚皮素、芹菜素、山姜素和柯因，其中槲皮素在椴树蜜、洋槐蜜和森林蜜中含量相似。Sergiel I等人[21]利用高效液相色谱串联质谱法对产自波兰的不同蜂蜜中的多酚类化合物进行分析，在椴树蜜中发现橙皮素、阿魏酸、咖啡酸和香草酸，其中咖啡酸和香草酸这2种酚酸化合物的含量较低，而阿魏酸在椴树蜜中的含量却高于波兰其他种类的蜂蜜，如洋槐蜜、荞麦蜜、油菜蜜等。此外，Michalkiewicz A等人[22]在椴树蜜样品中鉴定出没食子酸、对羟基苯甲酸、丁香酸、芦丁、槲皮素等。Truchado P等人[23]指出，椴树蜜中的短叶松素、松属素、柯因和高良姜素具有相对更高的含量。Cetkovic Gordana等人[24]认为，椴树蜂蜜中最丰富的多酚类化合物是没食子酸。Tomás-Barberán F A等人[25]研究欧洲椴树蜜，仅鉴定出少量松属素和短叶松素。因此，过去的研究显示，在鉴定椴树蜜中的多酚类化合物方面仍具有较大分歧，建立一种可靠、高效的能够分析鉴定椴树蜜中多酚类化合物的方法至关重要[26-27]。

通过高效液相色谱串联质谱法和气相色谱串联质谱法分析来自我国不同产地的椴树蜜样品，对其中的多酚类化合物进行鉴定，并分别构建紫椴蜜和糠椴蜜中多酚类化合物的高效液相指纹图谱，进而为我国椴树蜜的品质控制提供新的思路及方法依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

不同产地、不同时间采集的椴树蜂蜜样品共15份，其中紫椴蜜样品7份，编号为样品A，B，C，D，E，F，G；糠椴蜜样品8份，编号为样品H，I，J，K，L，M，N，O。采集后，将这些蜂蜜样品置于4℃冰箱中保存。

椴树蜜产地及时间样品的信息见表1。

4-羟基苯甲酸、p-香豆酸、丁香酸甲酯、5-甲氧基短叶松素、肉桂酸、短叶松素、柯因、松属素、山奈酚和短叶松素-3-乙酸酯，美国Sigma公司提供；顺，反-脱落酸、反，反-脱落酸，成都生物技术有限公司提供；甲醇（色谱级）、乙酸（色谱级），美国Fisher公司提供；甲酸，国产分析纯；超纯水（ΜΩ·cm）。

表1 椴树蜜产地及时间样品的信息

1.2 仪器与设备

LC-6AD型高效液相色谱仪，日本岛津公司产品；6540型四极杆飞行时间质谱（Q-TOF MS）、7890A（GC-MS/MS）型气相质谱仪，美国安捷伦科技有限公司产品；固相萃取柱Strata-X-A（60 mg/3 mL），美国Phenomenex公司产品；超纯水系统，美国Merk Millipore公司产品；24孔固相萃取装置，美国Supelco公司产品。

1.3 方法

1.3.1 椴树蜜样品前处理

在孙春丽和Dimitrova B等人[28-29]研究方法的基础之上进行了改进，具体操作流程如下：①固相萃取柱预处理，用4 mL甲醇对Strata-X-A SPE柱活化，再用4 mL超纯水对其进行平衡；②准确称取蜂蜜样品30 g，溶于120 mL超纯水中，搅拌至完全溶解，之后使用氨水将溶液调至pH值7；③将蜂蜜溶液以转速8 000 r/min离心10 min，除去固体不溶物。然后取上清液倒入预先处理的固相萃取柱中；④上样结束后，向萃取柱中加入4 mL超纯水清洗，然后用5 mL甲醇（含5%甲酸）溶液进行洗脱；⑤将洗脱液收集于试管中，通过氮吹仪（配有恒温水浴锅）将其干燥至恒质量，然后于2 mL甲醇溶液中复溶，最后使用0.22μm滤膜（Millipore，Carrigtowhill，Cork，Ireland）过滤，于4℃冰箱中保存备用。

1.3.2 高效液相色谱质谱分析条件

（1） 液相色谱条件。色谱柱250 mm×4.6 mm，5μm（Shim-Pack PREP-ODS），检测波长280 nm，柱温35℃，进样量20μL，流动相：A相为水（含0.1%乙酸），B相为甲醇（含0.1%乙酸），总流速0.7 mL/min；梯度洗脱程序：0～11 min，9%～14%B；11～18 min，14%～20%B；18～22 min，20%～21%B；24～30 min，22%～25%B；30～35 min，25%～30%B；35～39 min，30%～32%B；39～43 min，32%～33%B；43～54 min，33%B；54～59 min，33%～34%B；59～69 min，34%～36%B；69～74 min，36%～40%B；74～79 min，40%～45%B；79～86 min，45%～52%B；86～94 min，52%～57%B；94～104 min，57%～65%B；104～109 min，65%～70%B；109～115 min，70%～75%B。

（2）液相质谱条件。电喷雾离子化电离源（ESI），正离子、负离子双模式检测，离子源喷射电压4 kV，出口电压130 V，加热温度350℃，氮气流速11 L/min，雾化器流速80 kPa，压力40 psi，碰撞离子气体为 氦气，质量扫描范围为m/z=50～1 000，检测波长280 nm，总流速0.5 mL/min。

1.3.3 气相色谱质谱分析条件

气相色谱质谱条件：HP-5型毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25μm），载气为高纯氦气，流速45 cm/sec；柱初温60℃，恒温0.5 min后，以20℃/min升温速率升温至160℃，以8℃/min升温速率升温至175℃，以1.5℃/min升温速率升温至190℃，最后以9℃/min升温速率升温至280℃，保持5 min；分流比10∶1；扫描方式：SCAN；进样口温度：250℃，进样量1μL。

2 结果与分析

2.1 椴树蜜中多酚类化合物的定性、定量分析

通过建立多种多酚类化合物的HPLC检测方法，15个不同产地椴树蜜的色谱图如图1所示，样品A，B，C，D，E，F，G是紫椴蜜；样品H，I，J，K，L，M，N，O是糠椴蜜。在这些椴树蜜样品中共鉴定出13种多酚类化合物，分别为4-羟基苯甲酸、p-香豆酸、丁香酸甲酯、反，反-脱落酸、顺，反-脱落酸、肉桂酸、5-甲氧基短叶松素、短叶松素、山奈酚、松属素、短叶松素-3-乙酸酯、柯因，其中3号峰代表的化合物是首次在我国椴树蜜中发现，将其命名为椴树素。所有椴树蜜样品的色谱图大致相似，酚酸类物质出峰时间集中于65 min之前，黄酮类及其酯类物质集中于70 min之后出峰。但是，椴树蜜样品中化合物的种类和含量存在一定差异，紫椴蜜样品中酚酸类物质种类较多，黄酮类物质种类较少，椴树素含量最高；糠椴蜜样品中多酚类化合物种类较齐全，顺，反-脱落酸含量最高。

不同椴树蜜样品的HPLC色谱图见图1，椴树蜜样品中的多酚类化合物见表2。

图1 不同椴树蜜样品的HPLC色谱图

由于没有椴树素标准品，仅对其余鉴定出的多酚类化合物进行定量分析。采用相同的HPLC色谱分析条件，绘制12种多酚类化合物的标准曲线，根据标准品相对保留时间、紫外吸收光谱等，用外标法统计分析各个椴树蜜样品中多酚类化合物的含量，结果如表2所示。在所有椴树蜜样品中，酚酸类物质的平均含量为1 021.69μg/100 g，黄酮类物质的平均含量为214.92μg/100 g。其中，脱落酸含量最高，顺，反-脱落酸的平均含量达到250.17μg/100 g，是反，反-脱落酸含量的4倍。已有研究表明，椴树蜜中含有一定数量的脱落酸，与该试验研究结果具有一致性[19]。6种成分几乎在所有椴树蜜样品中稳定存在，包括p-香豆酸、反，反-脱落酸、顺，反-脱落酸、肉桂酸、柯因和椴树素，它们占总成分含量的80%左右。因此，初步推测p-香豆酸、反，反-脱落酸、顺，反-脱落酸、肉桂酸、柯因以及椴树素是我国椴树蜜中主要的多酚类化合物。

表2 椴树蜜样品中多酚类化合物的含量/μg·（100 g）-1

此外，以往研究显示，斯洛文尼亚的椴树蜜中鉴定出木犀草素、槲皮素、柚皮素、芹菜素等[20]；波兰的椴树蜜中发现橙皮素、阿魏酸、咖啡酸、香草酸、对羟基苯甲酸和丁香酸等[21-24]；欧洲的椴树蜜中仅鉴定出少量的松属素和高良姜素等[25]。这些研究结果表明，不同区域的椴树蜜中多酚类化合物的种类及含量存在很大差异。共鉴定出中国椴树蜜中13种多酚类化合物，是目前从我国椴树蜜中分离鉴定出多酚类化合物种类最多的报道。

2.2 椴树素的鉴定

利用高效液相色谱-质谱联用（LC-MS） 方法测得3号峰化合物的质荷比为165.090 85（M+H+），即可说明该化合物分子量为164，分子式为C10H12O2，计算不饱和度为5。

3号峰化合物液相质谱图（LC-ESI-MS）见图2。

图2 3号峰化合物液相质谱图（LC-ESI-MS）

由图2可知，质荷比为147.079 89是准分子离子脱H2O后的二级产物，因此表明该化合物分子结构中有1个氧原子是以羟基或羰基的形式存在。由质荷比为119.085 70可以知道，其来自质荷比为147.079 89的二级产物离子脱CO后的产物，以上分析得到高分辨质谱精确质量数且验证无误。结合有机质谱的裂解机理，分析该化合物分子结构中的2个氧原子是以羧基的形式存在，然后通过GC-MS/MS分析检出该组分，并结合图谱对该组分进行解析，如下：

3号峰化合物气相质谱图（GC-EI-MS）见图3。

图3 3号峰化合物气相质谱图（GC-EI-MS）

从GC-EI-MS图谱中可看出（见图3），在低质量端有显著的特征离子质荷比为45（CHO2+），表明化合物分子结构中存在羧基，进一步验证了LC-MS中的推论。GC-EI-MS图谱中虽然存在质荷比为39，质荷比为51，质荷比为77等苯环的特征离子，但是从其离子强度比例来看不符合苯环的裂解规律，所以确定该化合物分子结构中不含苯环。此外，低质量端的质荷比为41，表明该化合物分子结构中含有烯键，特征离子质荷比为79表明该化合物分子结构中含有脂肪环，而特征离子质荷比为45示意羧基的存在，因此可以分析该化合物分子结构中另外2个不饱和度将以2个环、或2个烯键、或1个炔键、或1个环加1个烯键的方式存在。2个环存在只能是1个四元环和1个三元环，而三元环张力大不稳定，予以排除；炔键在天然产物中很少见，且其所产生的特征离子质荷比为39理论要比质荷比为41显著，所以予以排除。因此可以得到剩余的2个不饱和度为1个环加1个双键或2个烯键，而根据碎片离子强度及该化合物的最大紫外吸收波长（λ=301 nm），可进一步排除环加双键的结构，即确定另外2个不饱和度来自2个烯键。结合该化合物分子结构中不包含苯环，所以确定另外2个双键的存在形式是环上和环外共轭结构。综合以上分析及碎片离子归属，推测出3号峰化合物为4-异丙基-1,3-环己二烯酸结构式。

4-异丙基-1,3-环己二烯酸结构式见图4，4-异丙基-1,3-环己二烯酸在EI源下的质谱裂解途径见图5，4-异丙基-1,3-环己二烯酸在ESI源下的质谱裂解途径见图6。

图4 4-异丙基-1,3-环己二烯酸结构式

图5 4-异丙基-1,3-环己二烯酸在EI源下的质谱裂解途径

综上所述，通过HPLC-MS及GC-MS/MS技术，鉴定出椴树蜜中3号峰化合物为4-异丙烯基-1,3-环己二烯-1-羧酸，首次在我国椴树蜜中被发现，因此将其命名为椴树素。

图6 4-异丙基-1,3-环己二烯酸在ESI源下的质谱裂解途径

2.3 构建紫椴蜜与糠椴蜜HPLC指纹图谱

相似度评价是指通过形成的对照指纹图谱与所选择的样品色谱图之间进行相似度匹配，从而对其评价[30-32]。近年来，该指标因其可作为食品药品质量监督的重要依据，被越来越多的研究者所重视[33]。将7个紫椴蜜的HPLC图谱数据与8个糠椴蜜的HPLC图谱数据分别导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版（2004） 软件，各自自动生成不同样品标记号S1～S7和S1～S8。选定紫椴蜜样品S1与糠椴蜜样品S1为参照图谱，自动生成标记号R，采用多点校正方法以消除各色谱图之间的保留时间误差，从而建立紫椴蜜与糠椴蜜样品的HPLC指纹图谱。

紫椴蜜、糠椴蜜HPLC指纹图谱见图7，紫椴蜜样品指纹图谱相似度见表3，糠椴蜜样品指纹图谱相似度见表4。

图7 紫椴蜜、糠椴蜜HPLC指纹图谱

表3 紫椴蜜样品指纹图谱相似度

采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版软件分别提取紫椴蜜样品与糠椴蜜样品色谱峰面积的数据，筛选色谱峰面积大于800 nA·min的色谱峰作为2种蜂蜜样品的共有峰。根据对比共有峰的保留时间和紫外吸收光谱等，最终确定6个指标峰的成分，分别为p-香豆酸、椴树素、反，反-脱落酸、

表4 糠椴蜜样品指纹图谱相似度

顺，反-脱落酸、肉桂酸和柯因。通过对2种不同蜂蜜样品共有峰面积数据的分析，发现紫椴蜜样品中椴树素与顺，反-脱落酸之间的峰高比值为1.6～6.8，糠椴蜜样品中椴树素与顺，反-脱落酸之间的峰高比值为0.24～0.50，说明紫椴蜜与糠椴蜜的HPLC指纹图谱具有一定差异。此外，由表3和表4可知，紫椴蜜样品的相似度范围为0.751～0.968，糠椴蜜样品的相似度范围为0.804～0.961。其中，50%以上样品的相似度高于0.9，说明花源相同的蜂蜜样品中多酚类化合物的HPLC指纹图谱相似度较高。因此，通过中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版软件分别建立的紫椴蜜与糠椴蜜中多酚类化合物的HPLC指纹图谱，可以成功地区分紫椴蜜与糠椴蜜。同时，结合以上椴树蜜中多酚类化合物的分析鉴定，初步推测椴树素和顺，反-脱落酸可作为鉴定我国椴树蜜的特征性指纹成分。但是，考虑到试验中蜂蜜样品数量及地理源有限等因素，应用HPLC指纹图谱区分紫椴蜜与糠椴蜜的研究还需更深一步的研究探讨。

3 结论

蜂蜜的花源不同，其多酚类化合物的种类及含量也会存在一定差异。通过HPLC-MS和GC-MS对我国椴树蜜中多酚类化合物进行研究，共鉴定出13种多酚类化合物，并使用外标法对其进行了定量分析。其中，4-异丙基-1,3-环己二烯酸为首次在我国椴树蜜发现，并将其命名为椴树素。通过椴树素和顺，反-脱落酸峰高比值及多酚类成分的高效液相指纹图谱，可实现紫椴蜜和糠椴蜜的明确区分，可为我国商品椴树蜜的质量评价提供一定的理论参考。