细胞壁对果实质地影响机制的研究进展

黄 欢,王绍帆,韩育梅

(内蒙古农业大学食品科学与工程学院,内蒙古呼和浩特 010018)

果实成熟过程中伴随着许多生理生化变化,主要有乙烯合成、呼吸作用增强、质地软化和色素及风味物质的生成等。其中果实的质地作为评价其商品价值的重要指标之一,是影响消费者喜好的关键质量参数。食品的质地被定义为,人们通过视觉、听觉、触觉等所检测到的食品的结构,机械及表面特性的感官和功能表现[1]。比如脆或粉,硬或软,粘度是否较大,是否有弹性等。目前,评价食品的质地的方法有感官评定法和仪器分析法两种,常用的是仪器分析方法,它可以通过仪器量化测定出食品的硬度、粘度、凝聚性、阻嚼性和弹性等参数。Dintwa等[2]指出果实质构的变化基本是由质构仪测定的宏观结果来表示的,但这并不能从本质上反映果实质构的变化机制。果实组织的基本结构是细胞,细胞的形态、结构、空间排列和完整性直接影响果实的机械特性,决定果实制品的质构[3]。植物细胞壁是由各种细胞壁聚合物构成,而这些聚合物中主要成分包括果胶,半纤维素,纤维素等[4]。很多研究发现,在果实的成熟软化过程中,质地发生变化的主要原因是细胞壁的降解,主要是果胶的降解,也与纤维素和半纤维素结构的变化有关系。

大部分研究表明,果实结构的软化与果肉细胞壁多糖的结构、组成、降解和溶解有着密切的联系[5]。各种细胞壁多糖之间相互交联以此来支撑细胞壁骨架复杂的空间结构,而交联降解方式不同,果实的质地特性也就会有差异。果实的成熟软化伴随着一系列的生理生化反应,在这个过程中,细胞壁修饰酶发挥着重要的作用,细胞壁修饰酶的活性变化常导致细胞壁多糖结构或组成发生变化,由此对果实质地造成影响[6]。

质地对果实采后处理,微生物安全性,保质期,消费者可接受性和进一步加工的适应性都有一定的影响。同时有研究表明保持果实良好的质地可一定程度提高储运过程中的抗病性及抗逆性[7]。目前,对果实加工的研究方向以及产业化生产不再仅限于追求更长的货架期,而是越来越倾向于接受在适度的贮藏时间内保持果实较好的质地特性[8]。因此,从本质上探究果实贮藏期质地变化的机制,最大程度延缓果实软化,为一系列保鲜技术对果蔬质地的影响提供理论支持,对提升果实贮藏品质具有一定的意义。本文从微观角度对果实质地变化机制进行了综述,主要在细胞壁多糖降解以及细胞壁多糖降解相关酶对果实质地变化的影响上进行了系统的分析与展望。

1 影响果实质地的因素

质地包括感官和机械两方面。果实组织的质地表达综合了许多因素,包括自体遗传信息的表达,环境的影响,采后处理贮藏以及产品加工方式的不同等,同时果实品种的不同也使其在质地变化上存在较大的差异。水果和蔬菜的质地主要由水分含量和组织结构特性决定,涉及的结构决定因素包括组织尺度、细胞结构、细胞尺度、细胞间粘附的程度、细胞壁强度以及膨压[9]。果实个体由软组织和支撑组织的外表皮构成,组织由大量细胞构成,细胞壁、细胞膜包被着细胞内容物构成了单个细胞,细胞之间通过中胶层粘结在一起[10]。其中细胞壁和液泡内水分引起的膨压为软组织提供力学支撑。而结合组织和外表皮的力学性质主要取决于纤维素和果胶物质。果肉细胞壁多糖组分(果胶、半纤维素与纤维素)内与组分间的交联是维持细胞骨架形态的基本单元[11]。

目前普遍研究认为果实质地主要取决于细胞的自身张力、细胞间的结合力及细胞壁构成物质的机械强度。Jovyn等[12]研究认为由纤维素(cellulose,CEL)和半纤维素(hemicelluloses,HC)交织而成的细胞壁,其经纬结构的变化及胞间层果胶物质的降解是造成果实质地变化的主要原因。这一过程涉及多聚半乳糖醛酸酶(PG)、β-半乳糖苷酶(β-Gal)、果胶甲酯酶(PME)等多种酶。近年来发现,细胞壁中性多糖的解离对果实的软化也起到了一定的促进作用,其相关的糖苷酶在果实软化中的作用也倍受关注,它们对促进果实软化的作用在许多果实中得到证实。大部分的学者都认为细胞壁是细胞的支撑物,细胞壁结构的改变以及多种细胞壁水解酶参与细胞壁的降解而导致果实软化。

除了细胞壁强度和特性之外,果实质地还与其组织或器官的膨胀特性有关,同时受诸如光合产物积累和细胞水分状况等因素影响[13]。

2 细胞壁结构及组成

细胞壁(cell wall)作为植物细胞区别于动物细胞的特征性结构之一,是由基质聚糖(半纤维素)、果胶网络(水溶性、螯合性和碱溶性)、刚性骨架(纤维素微纤维)以及少量结构蛋白和矿物质组成。在大多数物种中,主要的基质聚糖是木葡聚糖,其余大部分是取代或未取代的木聚糖和一些葡甘聚糖[14]。

其中果胶主要由两个共同延伸的同型半乳糖醛酸聚糖和鼠李糖聚半乳糖醛酸组成,其大量分支侧链(阿拉伯聚糖,半乳聚糖和阿拉伯糖聚糖)形成果胶的所谓“毛状区域”[15]。在此结构基础上,通常采用半乳糖醛酸与鼠李糖残基比例的变化来反映果胶主链的修饰,并用半乳糖基与鼠李糖残基比率以及阿拉伯糖基与鼠李糖残基之比来反映果胶侧链的修饰[16]。果胶物质富含半乳糖醛酸(GalA)并且由四种主要果胶组分组成:同聚半乳糖醛酸(HGA,半乳糖醛酸的大型线性未取代聚合物),木糖聚半乳糖醛酸(在HGA中存在单一木糖残基的少量取代)和两种类型支链鼠李糖聚半乳糖胺。鼠李糖聚半乳糖醛酸I(RG-I)具有半乳糖醛酸和鼠李糖的交替残基的骨架,其连接半乳聚糖和阿拉伯聚糖的大侧链[17]。鼠李糖聚半乳糖醛酸II(RG-II)具有与HGA相同的骨架,同时包含由许多不同糖基(包括几种稀有糖)形成的复杂侧链结构。纤维素由(1-4)-连接的D-葡萄糖链组成,通过氢键结合在一起形成长的结晶微原纤维,微原纤维包含由较少结晶区域围绕且被无定形形式的纤维素中断的高度结晶核心[18]。半纤维素以各种形式存在于细胞壁中,如木葡聚糖,葡甘露聚糖及葡糖醛酸阿拉伯木聚糖等,其中木葡聚糖是最丰富的。木葡聚糖通过氢键将纤维素微原纤维跨越相邻的微纤维条分布,从而将它们连接在一起。由于木葡聚糖可以聚集形成长链(数百微米),因此这种聚合物在细胞壁力学中起着重要作用[19]。其他半纤维素,在双子叶植物的原代细胞壁中较为丰富,也通过氢键交联微纤维,但较木葡聚糖弱。

细胞壁可粗略分为2种类型:初生壁和次生壁。前者为正在生长中细胞的细胞壁,通常生长发育旺盛部位的细胞只有初生壁;后者则是在初生壁和细胞质膜之间加厚的细胞壁,主要存在于植物机械组织等特定的细胞中[20]。初生细胞壁是可延展的,具有一定的弹性,松散度及可生长性。相比之下,次生细胞壁是不可延伸的,其严重增厚并且通常是木质化的[21]。果实薄壁细胞大多具有初代细胞壁,通常相对较薄。蔬菜组织通常含有较高比例的具有木质化细胞壁的细胞,由此(在其未加工状态下)比成熟的果实更硬。

3 细胞壁与果实质地之间的关联

细胞壁提供了刚性和强度,并且为细胞抵抗外界伤害起到保护作用,参与细胞识别,促进物质的渗透,具有可膨胀性,使果实具有一定的形状和弹性,其结构和成分的改变被认为是引起果实质地变化的主要原因。

3.1 细胞壁多糖的变化对果实质地的影响

Justyna等[22]研究发现细胞壁的力学性质取决于多糖组成,以及它们的组装和链接。细胞壁多糖修饰序列的改变,会导致原代细胞壁和中间层状结构的解体。细胞壁多糖的修饰涉及增加果胶溶解度和非葡萄糖中性糖(主要是半乳糖和阿拉伯糖)的损失。Jin等[23]研究了桃果实贮藏过程中细胞壁多糖的变化,发现了阿拉伯糖基残基从紧密结合的聚合物释放为不太牢固的附着形式是软化的重要机制。综上可知,果实细胞壁多糖组分(果胶、半纤维素与纤维素)内与组分间的交联是维持细胞强度的直接因素,果实的软化与导致细胞壁结构改变和组织凝结力下降的多糖解聚程度和糖分变化有关。

3.1.1 果胶的组成和结构变化对果实质地的影响 富含果胶的中间层起着连接相邻细胞的胶着作用,因此其是细胞间粘附的主要决定因素。Dong等[24]研究了不同品种的梨长期贮藏中,在细胞壁聚糖醛酸、酶活性的变化与质地结构的相关性方面,较高含量的水溶性果胶(WSP)减小了细胞粘附,其易使质地软化。Xiao等[25]研究发现细胞壁WSP和螯合性果胶(CSP)的含量、结构性质与苹果的质构特性明显相关,当WSP含量较高时,苹果表现出较低的脆度和较差的微观结构,这可能部分归因于果胶多糖的解聚和浸出。以上说明果实细胞壁多糖的种类占比与其质地具有相关性,在此基础上对细胞壁多糖的分子量分布及单糖组成进行深入探究,以构建细胞壁多糖结构特性与果实质地评价的关联体系,可以作为目前研究的方向。

果胶聚合物可以通过影响果胶功能性质的几种共价和非共价键彼此相互作用。果胶通过PME去除其甲基酯基团,留下羧酸基团,使细胞壁中的HGA积累负电荷。在Ca2+的存在下,不同HGA分子中带负电荷的半乳糖醛酸残基的结构域通过离子键与Ca2+缔合在一起,形成钙-果胶凝胶,增加了壁强度并为成熟果实中的大部分细胞提供了结合力。Njoroge等[26]在研究大豆不同浸泡条件下果胶多糖的变化中发现,相比对照在CaCl2溶液中处理的大豆中高摩尔质量聚合物增加,其细胞壁分离现象减少。数据表明Ca2+导致果胶交联增加和β-消除解聚减少。该特征与同型聚半乳糖醛酸的甲基化程度(DM)有关。DM<50%的低甲基化果胶链能够形成称为“蛋盒模型”的HG-钙复合物。根据该模型可以解释二价离子与多糖之间的分子间网络的形成。其中果胶链的二价离子胶凝取决于非甲基化的半乳糖醛酸残基的数目,至少需6～20个[27]。同时Munarin等[28]研究发现,不仅可以使用钙阳离子形成低甲基化的果胶凝胶,其他二价或三价阳离子也可以表现出这种性质。Mierczyńska等[29]利用流变学方法研究Ca2+,Fe2+和Mg2+在苹果改性细胞壁多糖制备的新型食品,对其基质性能的影响中,发现添加Ca2+和Fe2+的细胞壁多糖基质(MPS)与对照相比,弹性(储存)模量大于粘性(损失)模量,弹性模量随着Ca2+和Fe2+浓度的增加而增加,这表明凝胶结构随之增强,同时认为铁离子可以以与钙相似的方式交联果胶。与Ca2+和Fe2+相比,添加Mg2+可以减少凝胶化,因此,Mg2+可以作为果胶凝胶的抑制剂。

此外,研究表明果胶多糖还可以交联到其它细胞壁组分,如半纤维素,酚类化合物和蛋白质,这一定程度增加了细胞壁的结构强度和功能复杂性[30]。果胶形成独立的网络,与交联聚糖平行,其作为增塑剂和水结合剂起作用。果胶和交联聚糖的作用是与细胞壁中的纤维素微原纤维结合。通过与葡糖醛酸阿拉伯木聚糖和木葡聚糖的相互作用表明果胶与其他细胞壁多糖结合[31]。果胶与纤维素相互作用时,与聚糖存在竞争关系。当木葡聚糖浓度高时,果胶在纤维素上的附着较低,因此纤维素-果胶相互作用弱于纤维素和木葡聚糖之间的相互作用,而在低木葡聚糖浓度下,果胶的主要功能是结合微纤维之间的间隙[32]。Zhao等[33]通过对细胞壁多糖结构的研究,发现其支链结构越多越利于果胶多糖形成钙桥,同时纤维素小分子化将促进其与果胶的结合,从而提高果实硬度。

3.1.2 纤维素微原纤维对果实质地的影响 果胶被认为是组织结构性质改变的原因,而纤维素微原纤维在果实组织机械特性中的作用通常被忽略。纤维素被认为是最稳定的聚合物,果实成熟与纤维素和果胶的结构变化有关。因此,纤维素形成了一种细胞壁的机械基础,微纤维的组织和尺寸预计将在细胞壁和组织的机械性质中起重要作用。Cybulska等[34]使用原子力显微镜研究苹果质地与细胞壁纳米结构的关系,结果表明微纤维厚度影响细胞壁的机械强度,这对感官及质地具有影响,较厚的纤维素微原纤维对应于较硬的组织,结晶度水平往往与纹理呈负相关。

3.2 细胞壁中结构蛋白对果实质地的影响

细胞壁中存在几种结构蛋白,主要是富含羟脯氨酸的糖蛋白(HRGPs),其也会对果实质地产生影响,其中扩展蛋白是缺乏水解活性的细胞壁修饰蛋白,研究者认为它可以通过破坏基质聚糖和纤维素微原纤维之间的结合而导致果实软化[35]。David等[36]发现在成熟番茄中过度表达相关的扩展蛋白会导致其基质聚糖解聚显著增加,软化加快,而通过抑制扩展蛋白的表达可减少果胶解聚,维持果实硬度。同时膨胀素作为在生物质处理中潜在的辅助蛋白质,以获得可用于乙醇生产的可发酵糖,降低了纤维素的结晶度,从而促进了果实软化[37]。细胞间粘附的另一主要影响因素是细胞间接触的程度,其由细胞形状和包装,水分损失以及细胞间空隙的大小决定,这些因素是随着水果成熟而变化的。而在成熟期或者后续贮藏期间,细胞壁成分结构的改变使得可溶性果胶多糖组分含量升高,细胞壁自身发生膨胀,减弱了细胞壁强度。这两个因素在一定程度上相关,细胞壁在成熟过程中发生膨胀,形成疏松多孔的结构,进而促进了细胞壁解体和中间层的结合降低了壁的强度同时降低了细胞间粘附。

3.3 细胞壁降解酶与果实质地变化的关系

果实质地主要受细胞壁结构解体和细胞壁组分解聚的影响,其中涉及多聚半乳糖醛酸酶(PG)、果胶甲酯酶(PME)、果胶酸裂解酶(PL)、内切-1,4-β-D-葡聚糖酶(EG)、木葡聚糖-内切转糖苷酶(XET)、β-半乳糖苷酶(β-Gal)、α-阿拉伯呋喃糖苷酶(α-AF)等细胞壁水解酶的协调和相互作用。其中PME从HG的甲基酯化中除去甲醇基团,PME使甲酯化的原果胶去甲酯后,PG裂解未酯化果胶中的α-(1,4)-半乳糖醛酸键使其降解,影响细胞壁的完整性和坚实度,促进果实软化[38]。EG能够降解纤维素,导致细胞壁中“经纬结构”松散,促进果胶质被果胶酶分解,加速果实的成熟与软化。PL通过β-消除裂解去酯化果胶[39]。同时细胞内容物的酶促降解也会导致果实的软化,例如淀粉在淀粉酶的作用下水解转化为可溶性糖,进而代谢导致细胞膨压下降,影响果实质地[40]。

果实成熟软化时在细胞壁中发生的最显著的变化是果胶物质的溶解。果胶是果实细胞壁中胶层的重要组成成分,对细胞间的黏连起着重要作用,果胶的降解特别是多聚醛酸的降解,能造成细胞黏度下降,最终导致果实的软化。而果胶的降解的主要原因是酶促果胶转化,其中广泛的内源性和外源性酶可协同修饰和降解果胶光滑和毛状区域[41]。光滑的区域,在空间分布上较有规律,涉及的酶主要是酯酶或解聚酶,而毛状区域是由多个不同的单糖组成的杂聚体,包括RG-I和RG-II两个小区,一般来说毛状区相对不易受到果胶酶的降解[42]。

3.3.1 酯酶—果胶酯酶(PME) 果胶酯酶PME广泛分布于植物中并通过静电相互作用与细胞壁结合,其作用是去除果胶分子链上半乳糖醛酸残基C-6羧基上的甲醇基,主要是羟甲基或羟乙基,催化果胶酯酸转化为果胶酸,增加果胶的溶解性,利于PG的作用。因此,PME的活动是PG活动的必要前提。PME催化植物细胞壁内HGA的特异性脱甲基作用,释放甲醇和质子(并产生带负电荷的羧基)。脱甲氧基化的HGA可以形成超分子组装体或与二价离子(例如Ca2+,Mg2+)交联导致凝胶化,此外,果胶脱甲氧基化可能导致果胶β-消除解聚受限[43]。Almeida等[44]研究发现果胶脱甲基化作用导致了果实成熟过程中质外体中离子条件的变化,改变了离子平衡,降低了pH,因此这可能会改变酶的活性和带电蛋白在壁基质内的扩散。较低的PME活性不会将甲基酯化的聚天冬氨酸转化成脱甲基化的聚天冬氨酸,因此延迟了细胞壁的降解维持了果实质地。PME作用下的果胶HGA的脱甲基化开始于果实成熟或早熟期。PME活性在成熟早期达到峰值,但在整个果实发育过程中都保持相对较高的水平。李春燕等[45]研究发现PME、PG一直伴随甜橙果实整个生长发育的全过程,不同种类甜橙的PME、PG活性都以成熟期为转折点,PG和PME两种酶活性的增加,果胶物质分解,果实硬度下降。Phan等[46]研究发现,在转基因番茄成熟过程中PME活性降低,且番茄硬度有所降低,这可能是由于影响了钙-果胶分子之间交叉桥的形成能力。

3.3.2 解聚酶—多聚半乳糖醛酸酶(PG);果胶裂解酶(PL) 解聚酶包括水解酶(PG)和裂解酶(PL),实际中广泛应用于增加果汁出汁率和稳定性,降低粘度。羟基化酶通过酸/碱辅助催化裂解糖苷键,而PL通过β-消除反应机理使果胶解聚。它可以是内作用或外作用的,并且活性可以限于短寡糖。在毛状区域,RG-I中的α-1,4键被鼠李糖半乳糖醛酸酶和鼠李糖半乳糖醛酸聚糖裂解酶水解,而α-1,2键被鼠李糖半乳糖醛酸水解酶或鼠李糖半乳糖醛酸聚糖水解酶切割。毛状区域降解酶可以进行内作用或外作用。RG-I的大侧链的降解被认为可以增加细胞壁孔隙率和开放度,由此便于驻留在细胞壁空间中的降解酶进入并作用于多糖底物。在植物细胞壁中,基质组分的每种结构组分/聚集物都被多种修饰酶靶向。一种修饰机制可能协同改变另一种修饰机制的作用或功效,特别是考虑到许多细胞壁水解酶和裂合酶的结构特异性。PL被认为是植物中的外源性来源,然而,Owino等[47]在许多植物基因组中发现了大量PL样序列。Zhou等[48]研究发现草莓中的PL基因主要在草莓成熟阶段进行特异性表达,PL的表达与PL的活动密切相关,其与草莓硬度的变化呈负相关。

PG作用必须先经过由PME产生的去酯化作用。通过PME对聚半乳糖醛酸主链进行去酯化可促进PG对果胶的解聚。果胶分子的主链是以α-1,4糖苷键聚合的不同酯化度的半乳糖醛酸链,PG催化水解α-1,4糖苷键,作用方式分为随机作用和终端作用两种方式,分别称为内切PG(endo-PG)和外切PG(exo-PG)它可引起果胶裂解,产生低聚半乳糖醛酸或半乳糖醛酸,使细胞壁解体,从而导致果实软化[49]。研究表明,在番茄中,PG的转基因抑制导致改善了细胞壁中间片层的完整性而改善了其抗逆性,提高了货架期[50]。

3.3.3 糖苷酶 然而,有研究表明,抑制PG和PME并没有对果实质地的维持起到较好的作用。考虑是由于果实组织中的壁刚度和细胞间内聚力也部分归因于含有阿拉伯半乳糖和半乳糖的交联。交联聚合物的改性可能导致在成熟期间发生细胞壁结构和果实硬度的变化。因此果实软化可能至少部分归因于裂解除半乳糖醛酸以外的交联糖间的化学键。David等研究发现在番茄、芒果等几种水果中,糖苷酶对其细胞壁结构的松动以及果实的发育和成熟发挥着重要作用[51]。β-半乳聚糖主要存在于RG-I的侧链上。这些链与纤维素的葡聚糖链缠绕,形成致密的网络,其有助于细胞壁的可伸长性,强度和孔隙率。β-半乳糖苷酶的作用是从细胞壁去除半纤维素和果胶的末端非还原性β-D-半乳糖残基使果胶和半纤维素降解,同时也能降解糖蛋白和糖脂,使细胞壁中一些组分变得不稳定促使细胞壁膨胀进而影响果实质地。Ng等[52]研究认为β-Gal可以通过增加细胞壁的孔隙率和增强其它细胞壁降解酶的进入来加速果实软化。β-Gal活性的改变会导致果胶溶解和细胞壁结构的差异,并导致不同的质地类型。在果实质地软化过程中还可能发生RG-I阿拉伯糖侧链的降解,这由α-阿拉伯糖苷酶的活性决定。α-AF能够水解非还原呋喃阿拉伯糖残基,使细胞壁阿拉伯半乳聚糖、阿拉伯甘露聚糖等中性糖不断解离,促进果胶的增溶和降解。Pea等[53]发现在果实成熟和软化过程中,聚合阿拉伯糖有着明显损失。在苹果中,其软化之前发生了分支阿拉伯聚糖的降解。与细胞壁半乳糖的降解一样,在大多数果实的成熟过程中,细胞壁阿拉伯糖的损失都会发生。

不同种类及品种的果实,其影响质地变化的主要相关酶也有所不同。张娟等[54]研究细胞壁相关代谢酶对不同品种的苹果的质地影响大小,发现PG和PME酶是‘秦冠’果实质地变化的关键酶,而β-Gal在‘富士’质地变化中发挥关键作用。Jo等[55]提出了一种影响果实质地的非酶机制—抗坏血酸作用会影响果实软化,研究表明抗坏血酸含量在番茄果实成熟软化过程中增加。由此认为果胶分解酶的高水平表达和抗坏血酸含量的增加对果实细胞壁中生物聚合物的空间分布具有显着的影响。

4 结论与展望

质地软化是果实成熟的一个重要标志,综上所述,果实成熟后质地的软化涉及果实中初生壁和胞间层组织中一系列相互协调的多糖降解过程,从而引起细胞壁超微结构发生变化。细胞结构的变化与果实成熟软化关系较密切已被广泛证明,但难以确定具体的细胞壁结构的变化引起的生理效应。利用不同物性仪进行硬度和组织拉伸等质地测试,利用高效液相色谱法、化学方法、分光光度法和同位素示踪技术测定各种酶活性、多糖组分组成及含量,利用相关性分析研究宏观质地与微观降解的关系,从而进一步阐明果实细胞壁的结构和组分变化以及引起这些变化的原因。目前利用基因工程技术已出现了果实软化过程部分细胞壁变化涉及的酶的作用和性质的相关研究成果。但是,类似的研究所得的结果却并不一致,甚互相矛盾。因此,如果要控制果实软化,还需要针对不同种类的果实控制不同的酶活性。通过对不同品种水果的理化指标和微观结构相结合的研究是一个较新的研究思路。以上对于揭示实践中使用的保鲜处理等方法保持果实质地的机理进而优化贮运参数有理论和技术指导意义。