白三叶抗冻性研究

赵梅，周瑞莲，王振南

（1.山东省产品质量检验研究院，山东济南 250100；2.鲁东大学生命科学学院，山东烟台 264025；3.临沂大学农林科学学院，山东临沂 276000）

三叶草（Triforlium hybridum）属多年生草本植物，是温带地区广为种植的优质豆科牧草[1]，全球250余种，最重要的有10种，我国常见的野生种有白三叶、红三叶、草莓三叶草和野火球等；引自国外的有杂三叶、绛三叶、地三叶、埃及三叶4种[2-3]。目前，我国研究栽培较多的是白三叶、红三叶和地三叶。

白三叶草又名白车轴草，原产于欧洲及小亚细亚地区[4]，经过多年的研究发现，白三叶是三叶草中表现最好的系列，其综合性状优于红三叶和杂三叶。

本文结合目前白三叶抗冻性研究现状，生理生化调控机理、抗冻基因工程研究、白三叶的应用及栽培中存在的问题进行综述，归纳了国内外对白三叶抗冻性研究的进展，旨在为白三叶抗冻性研究提供大量理论基础，为其全面推广及在未来提高白三叶抗冻性在园林绿化中的应用提供科学依据。

1 白三叶抗冻性形态生理学研究现状

1.1 白三叶抗冻形态学特征研究

白三叶根的结构有利于抵抗低温的伤害。多年生草本植物之所以能在各种各样环境中生存，维持其无性系群体数量的稳定性，其机理在于多年生草本植物一般都具有从母体分成独立植株进行营养繁殖的能力。大量研究已经证实：许多无性系植物的各器官（如分枝、匍匐茎或根状茎）在生理上与和他们相连的器官整合，用于生长的物质可在它们之间进行转运[5]。单一器官或整个植株的功能受整合反应强烈影响，能满足任何器官的物质需要，或缓冲胁迫造成的影响。

白三叶根的组织结构与抗寒性也有密切相关性。赵伟等[6]对瑞文德、海发、铺地、小黑龙4种白三叶进行-10℃的低温处理，研究了根的结构与抗寒性关系，他们发现抗寒性最强的小黑龙根次生结构中木质部比率最大，韧皮部比率最低，导管直径最小；抗寒性最差的海发根次生结构中木质部比率最小，韧皮部比率和导管直径最大。这说明根的组织结构与抗寒性存在着遗传上的相互制约关系，反映了白三叶品种间抗寒性在遗传上的结构特征，可作为白三叶品种抗寒性的鉴定指标。

1.2 白三叶抗冻生理生化机理研究

1.2.1 白三叶叶片细胞膜稳定性与抗冻性关系

在植物的抗寒研究中发现，细胞膜可能是冻害发生的首要位置，膜系统损伤首先是冷冻引发的严重脱水所致[7]。大量研究结果揭示和证实，细胞的各种膜系统，如线粒体、叶绿体、液泡膜和质膜等的稳定性与植物的抗寒、抗旱等抗逆性有着密切的关系，而质膜的稳定性与其他膜系统相比则具有更重要的作用，可以说是关键中的关键。

白三叶的抗冻性与细胞膜透性有着密切的关系。范玉贞[8]于2009年研究了10℃和0℃下白三叶电导率和MDA含量的变化，结果显示：随着胁迫温度的降低，电导率和MDA均呈升高趋势。电导率从对照的2.27%增加到3.69%（1O℃）和7.84%（0℃），10℃和0℃低温处理的电导率分别是对照的1.63倍和3.45倍，这表明，随着胁迫温度下降，膜系统的透性显著增加。

白三叶细胞膜脂肪酸的成分也影响其抗寒性。许多研究者发现，生长在低温中的植物，其膜脂中的不饱和脂肪酸的含量高，膜相变温度也随之降低，且与植物的抗寒性成正相关[9]。

1.2.2 低温胁迫下白三叶草光合作用的适应性变化

目前，对低温下植物光合作用变化的研究较多，但是结果并不一致。例如，有研究发现，低温胁迫下植物的光合作用往往会下降。例如苜蓿幼苗经-5～-6℃处理4h后，最大净光合速率降低[10]。这是因为植物在低温胁迫下，由于水分对保卫细胞的供应不足，导致保卫细胞的膨压不足，致使气孔不能张开，光合作用下降；还有人认为，低温导致气孔关闭，降低了细胞间隙中的二氧化碳浓度，光合作用降低。但是Martin等[11]认为，低温之所以会造成光合作用降低，是由于低温下光合作用器官操纵二氧化碳浓度升高，导致气孔关闭，也就是说，低温下光合作用的降低主要是由非气孔因素造成的[12]。

1.2.3 渗透调节物质对白三叶抗冻性的作用

兼容性物质的合成和积累，冷诱导蛋白的合成及碳水化合物代谢的变化，（Becket al.,2004）都能维持生物膜结构的稳定性，增加植物的抗冷抗冻性。

大量研究发现，碳水化合物可以提高植物细胞的渗透势，降低水势，稳定细胞壁，为代谢提供能源，所以被认为可以提高植物的抗冻性[13]。刘艳红等[14]对高山冰缘植物粗脂肪、可溶性糖和类黄酮的含量变异与环境适应关系进行研究发现，高山冰缘植物积累高含量的可溶性糖，提高了植物抗冻和抗紫外线辐射的能力，是植物适应冰缘环境的物质基础。

低温胁迫下，白三叶细胞内淀粉和可溶性糖积累量也会发生变化。Tronsm[15]通过研究冰冻和脱冻条件下两种草中可溶性糖含量和糖苷酶活性的变化发现，在冰冻和脱冻条件下，可溶性糖的总量变化不大，但是在冰冻时可溶性糖会转化成寡糖，蔗糖和低聚多糖含量增加。这表明，冷冻条件下，蔗糖的活性提高；脱冻后活性下降，α-半乳糖苷酶活性增加，由此得出，糖苷酶的活性可能与冷冻时期多糖的动态变化有关。

1.2.4 抗氧化酶系统对白三叶抗冻性的作用

安莹[16]研究了低温对白三叶保护酶活性的影响，她发现，在15～-10℃的温度梯度下，白三叶叶片中POD和SOD两种抗氧化酶的变化趋势基本一致，并且当温度降到-5℃时，叶片内SOD和POD两种保护酶活性会急剧升高，清除活性氧自由基，从而避免膜伤害。

这表明，低温逆境条件下，白三叶草的抗氧化酶系统能够清除细胞产生的大量氧自由基，调节机体代谢，对维持机体正常生长起着关键的作用。

2 白三叶抗冻基因工程研究进展

长期以来，人们试图通过基因工程的方法提高白三叶的适应性，但其组织的有效再生一直是白三叶基因工程研究中无法克服的困难。其实，有关白三叶的转基因研究开始的较早，早在1987年White就建立了其转化体系，用农杆菌介导法获得首例转基因白三叶植株[17]。

关于白三叶的抗寒育种以前主要采用传统常规育种技术和方法，但由于其周期长、效率低、工作繁琐，不适应现在农业发展的要求[18]。最近十年来，随着对抗寒分子机理认识的不断加深，人们不断尝试采用基因工程手段培育抗寒新品种。1989年，Bowler等[19]把烟草的Mn-SODcDNA导入苜蓿中，发现转基因植物SOD活性增强，将SOD的cDNA导入烟草、番茄和苜蓿中，大量表达后提高了植株抗氧化能力[20]。

抗冻蛋白（antifreeze proteins，APFS）是1969年Devrise首次从南极极地海鱼中的血液中发现的，在鱼类和昆虫中研究比较深入。植物AFPs的研究起步较晚，20世纪90年代初期才开始研究，1992年，加拿大Griffith等（陈儒钢等，2008；）首次报道从经过低温锻炼可忍受细胞外结冰的冬黑麦中发现了植物内源性AFP，标志着植物抗冻蛋白研究的开始。

3 存在问题及展望

白三叶具有较长的匍匐茎，可进行无性系繁殖，节与潮湿的土壤接触产生不定根，当老组织死亡时，这些不定根为匍匐茎提供营养，增加了匍匐茎的生存机会。这种独特的繁殖方式，使白三叶可以抵抗低温冰冻胁迫，因此，在我国北方地区广泛种植。

随着城市绿化建设的迅速发展，草坪伴随人们户外运动、娱乐地、休假地设施的发展而兴起，由于白三叶草草坪保绿期长（一般在200天以上），繁殖快、生长迅速、适应性强、耐荫、栽培管理简单、不需要修剪，所以白三叶可作为观赏草坪应用，我国的沈阳、哈尔滨、北京等地都用白三叶草作观赏草坪。

此外，白三叶是果园生草良种。果园生草就是在果园内种植对果树生产有益的草，它是果园保持水土、增加土壤有机质和提高土壤肥力、改善果树生态环境的有效措施，在发达国家早已普及，并成为果园科学化管理的一项基本内容。

虽然白三叶草具有很高的应用价值，但是经过十几年的种植，白三叶草坪的一些缺点和不足逐渐显露出来，甚至有人提出将白三叶列为恶性杂草，在园林造景中严禁使用[21]。

首先，白三叶草的侵占性特别强，危害其他草坪草的生长。由于白三叶的适应性特别强，当种子落入杂草或公园其他草坪中后，很快会生长繁殖，快速生根、匍匐茎和根群，其它草坪草的生长环境会受到限制，生活力逐渐下降，当白三叶生长2～3年后逐渐成为优势种取代其他草坪草。

因此，当混播草坪种有白三叶植株时应及早连根铲除，以免侵占其他草坪草。另外，可以将白三叶草作为封闭型观赏草坪建植，建立独立的花坛、或者具有独立观赏价值的城市道路隔离带，避免白三叶草种子扩散。