血清Th1/Th2型细胞因子在乙肝感染不同时期的表达及其临床意义*

沈轶骊,喻霞云,丰 斌,黄祖兴，王 琳△

(1.苏州大学附属第一医院临床检测中心,江苏苏州 215000；2.苏州大学，江苏苏州 215000)

乙型肝炎病毒(HBV)的持续感染是一类发病机制较为复杂的疾病，目前认为，细胞免疫在乙肝疾病的发生、发展中起着重要的作用[1]。辅助性T细胞(Th细胞)根据分泌的细胞因子不同分为Th1、Th2 2个亚群，Th1/Th2平衡在维持机体免疫功能中起着重要的作用[2]。研究发现，当机体发生HBV慢性感染时，会出现“Th1/Th2平衡漂移”的现象。因此，本研究运用酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测HBV感染患者血清中Th1和Th2相关细胞因子的表达水平，探讨乙肝患者细胞免疫状态(Th1/Th2)和乙肝慢性化之间的关系。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2012年10月至2013年6月苏州大学附属第一医院感染病科收治的102例HBV感染者，其中女28例、男74例，平均年龄(49.68±15.41)岁。将102例HBV感染患者分为3组：(1)慢性乙型肝炎(CHB)组：共42例，其中女10例、男32例，平均年龄(39.38±14.31)岁。(2)肝硬化(LC)组：共30例，其中女12例、男18例，平均年龄(56.18±11.90)岁。(3)原发性肝癌(HCC)组：共30例，其中女6例、男24例，平均年龄(55.38±13.42)岁。根据2010年修订的《慢性乙型肝炎防治指南》诊断标准[3]，所有患者均乙肝表面抗原阳性，并剔除丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒(HDV)、艾滋病病毒(HIV)等重叠感染以及其他原因引起的肝脏损害。(4)健康对照组(NC)：共30例，其中女15例、男15例，平均年龄(43.51±8.53)岁，健康对照组收集于苏州大学附属第一医院健康管理中心，无肝炎病史且乙肝标志物测定均为阴性。

1.2仪器与试剂 Bio-Rad 680酶标仪购自于美国Bio-Rad公司；白细胞介素4(IL-4)、白细胞介素6(IL-6)和γ干扰素(IFN-γ)ELISA检测试剂盒购于美国BioLegend公司。

1.3方法

1.3.1检测方法 采用双抗体夹心ELISA法检测血清中IL-4、IL-6和IFN-γ水平。操作步骤按照美国BioLegend公司试剂盒说明书进行。

1.3.2结果计算 通过标准品测定建立标准曲线，以吸光度OD值为纵坐标，水平为横坐标，得到标准曲线回归方程Y=aX+b。测定样品的OD值，通过标准曲线计算得到其水平。

2 结 果

2.1一般资料分析 由表1可知HBV感染者中，CHB、LC、HCC组患者的年龄、性别2个基本临床资料差异有统计学意义(P<0.05)；与乙肝相关的HBeAg阳性率、ALT水平及HBV DNA载量差异均有统计学意义(P<0.05)。

表1 HBV感染不同阶段的一般资料分析或M(P25～P75)]

2.2HBV慢性化患者血清细胞因子检测结果分析 由表2、图1～4可知，IFN-γ、IL-4、IL-6水平在各组间比较差异均有统计学意义(H=26.62、58.63、47.29，P<0.01)。经两两相互比较可知，IFN-γ、IL-4、IL-6水平在CHB、LC和HCC组均高于对照组，且差异有统计学意义(P<0.05)；IL-4水平在CHB组高于LC组和HCC组，且差异有统计学意义(P<0.05)；IL-6水平在HCC组高于CHB组和LC组，且差异有统计学意义(P<0.05)；与对照组相比，IFN-γ/IL-4的比值在CHB组、LC组和HCC组都明显减小，其差异有统计学意义(H=9.63，P<0.05)。

表2 HBV感染不同时期患者血清中细胞因子检测结果分析[M(P25～P75)]

注：与对照组比较，aP<0.05，bP<0.01； LC组与HCC组IL-4表达水平与CHB组比较，cP<0.01； CHB组、LC组IL-6表达水平与HCC组比较，dP<0.01

图1 CHB、LC、HCC组与健康对照组IFN-γ水平比较

图2 CHB、LC、HCC组与健康对照组IL-4水平比较

图3 CHB、LC、HCC组与健康对照组IL-6水平比较

2.3细胞因子表达量与HBV DNA载量、ALT和HBeAg相关性分析 HBV慢性化患者血清中IFN-γ水平与HBV DNA的载量、ALT呈不同水平程度的负相关(r=-0.786、-0.713,P<0.001)(图5～7)；IL-4水平与HBV DNA载量呈正相关，差异有统计学意义(r=0.757,P<0.001)(图8)；而IFN-γ、IL-4、IL-6在慢性乙肝患者外周血清中的水平与HBeAg没有显著的相关性(P>0.05)(表3)。

图4 CHB、LC、HCC组与健康对照组Th1/Th2比较表3 不同阶段HBV感染患者血清中细胞因子水平与HBeAg相关性分析[M(P25～P75)]

HBeAgnIFN-γ(ng/mL)IL-4(pg/mL)IL-6(ng/mL)阳性362.06(1.03～3.64)90.75(66.65～120.20)3.45(1.94～5.78)阴性662.06(1.19～3.32)90.99(54.54～120.38)3.46(1.86～8.69)U-1 149.501 065.501 128.00P->0.05>0.05>0.05

注：-表示无数据

图6 IFN-γ水平与HBV DNA载量相关性分析

图7 IFN-γ水平与ALT水平相关性分析

图8 IL-4水平与HBV DNA载量相关性分析

3 讨 论

HBV的感染，从携带HBsAg抗原发展为CHB、LC,最后演变为HCC是个长期的持续过程[4]。最新研究发现，Th1/Th2细胞功能的失衡可能会使HBV感染转为慢性化[5]。当Th1细胞占主导时，机体清除HBV病毒，使其恢复；而当Th2细胞占主导时，机体处于慢性持续感染状态[6]。最近有研究者对HBV感染后处于免疫耐受、免疫清除及急性期乙型肝炎分析发现,患者体内的细胞因子水平及Th1/Th2比率都发生了明显的改变，与健康对照组比较，乙肝患者Th1/Th2比率显著升高，但在以上3个疾病阶段未发现明显差异[7]。为进一步了解HBV感染患者T细胞免疫功能状态，在本课题组之前对乙肝患者T细胞表面相关免疫分子的研究基础上[8-9]，笔者主要研究了在HBV感染的不同阶段，患者外周血细胞因子(IFN-γ、IL-4、IL-6)的表达水平，进一步探其T细胞免疫状态与乙型肝炎病毒感染慢性化两者的相关性。

IFN-γ和IL-4在HBV患者血清中的表达水平明显高于健康对照组，但IFN-γ/IL-4比值明显低于健康对照组,这与施文娟等[6]发现CHB患者血清中IFN-γ水平显著升高相一致。笔者对CHB、LC和HCC组还进行了两两相互比较，结果显示，IL-4水平在CHB组高于LC组和HCC组，且差异有统计学意义，IFN-γ的水平在CHB、LC和HCC组未见显著变化。推测机体感染乙肝病毒后，激活Th细胞，分泌多种细胞因子。与分泌Th1型细胞因子相比，Th细胞分泌了更多Th2型细胞因子，诱导细胞免疫平衡向Th2方向倾斜，机体表现为HBV感染慢性化。根据研究，笔者还发现IL-6水平在HCC组高于CHB组和LC组，且差异有统计学意义。已有研究者报道乙肝病毒感染相关肝癌的进展中，IL-6和TNF-α水平会显著升高[10]。感染乙肝病毒后，机体的免疫系统受到刺激，免疫细胞激活后会分泌多种细胞因子，诱导机体产生IL-6等炎性细胞因子，这些炎性细胞因子会介导肝细胞损伤，最终导致肝纤维化[11]。

同时笔者将乙肝病毒感染患者血清中IFN-γ、IL-4、IL-6水平与HBV DNA载量、HBeAg和ALT等检测结果进行相关性分析，结果发现，IFN-γ的表达水平与HBV DNA的载量、ALT呈不同水平程度的负相关；IL-4的表达水平与HBV DNA载量呈正相关，差异有统计学意义。

HBV DNA载量可衡量乙肝病毒持续存在，且在乙肝慢性化进程中呈现出显著差异，HBV DNA载量在CHB患者、LC患者、HCC患者中逐渐较少。据此笔者推测IFN-γ和IL-4水平与乙肝病毒感染相关。ALT的水平可筛选肝脏疾病[12]，ALT水平在乙肝慢性化的进展过程中，呈现出显著差异，这提示IFN-γ可能与乙肝病毒感染相关，由此笔者推测IFN-γ可作为监测乙型肝炎患者T细胞免疫功能的新指标。

通过对HBeAg阳性和阴性分组研究发现，IFN-γ、IL-4和IL-6在血清中的表达没有明显的统计学差异，但研究表明，在乙肝病毒感染不同阶段，HBeAg阳性率差异具有统计学意义，提示HBeAg可用于筛选肝脏疾病。需要指出的是，笔者在实验中发现，年龄及性别在HBV感染不同时期差异有统计学意义，这与多数学者认为两者在乙肝不同时期无差异不一致[13]。考虑原因是收集不同感染时期的标本数量较少，导致结果有差异，后期将继续扩大标本量研究。

4 结 论

IFN-γ与IL-4水平比例失衡可能与患者乙肝病毒持续感染有关，导致乙肝病毒无法清除。提示IFN-γ可作为新的监测指标与HBV DNA载量、ALT和HbeAg共同反映HBV感染不同阶段患者T细胞的免疫功能，这可以为进一步研究乙肝患者免疫功能提供线索，为临床治疗和预后判断带来福音。