牛黄清心丸(局方)中樟脑限量检查*

聂黎行，戴忠，马双成

(中国食品药品检定研究院，北京 100050)

牛黄清心丸(局方)由牛黄、当归、川芎、甘草、山药、黄芩、炒苦杏仁、大豆黄卷、大枣、炒白术、茯苓、桔梗、防风、柴胡、阿胶、干姜、白芍、人参、六神曲(炒)、肉桂、麦冬、白蔹、蒲黄(炒)、人工麝香、冰片、水牛角浓缩粉、羚羊角、朱砂、雄黄等29味中药材粉碎配研制成，具有清心化痰、镇惊祛风的功效，用于风痰阻窍所致的头晕目眩、痰涎壅盛、神志混乱、言语不清及惊风抽搐、癫[1]。方中冰片起开窍醒神的作用，为合成品，主要成分为龙脑，合成过程可产生副产物异龙脑和樟脑，后者内服可致中毒[2]。冰片与樟脑，外形相似，气味相近，因其与樟脑的价格差异，市场上存在冰片样品掺入樟脑的问题[3-4]，但口服药品中樟脑的安全控制尚未引起重视，有关中成药中樟脑限量检查的研究报道较少[5-6]。气相色谱法具有简便、准确、快速、灵敏等优点，已被广泛用于中药的质量控制[7-9]，笔者采用气相色谱法建立牛黄清心丸(局方)中樟脑的限量检查方法，为该类药品的安全性评价提供了实验基础。

1 仪器与试药

1.1仪器 Mettler AE240电子天平(梅特勒-托利多仪器公司，感量：0.01 mg)、Mettler FX-200电子天平(梅特勒-托利多仪器公司，感量：0.1 mg)，KQ3200DB 型数控超声波清洗器，Agilent 7890N气相色谱仪。

1.2药品与试剂 樟脑对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110747-201008)。牛黄清心丸(局方)(9个厂家，38批次，均为2014年国家药品监督抽验样品)。冰片、牛黄、当归、川芎、甘草、山药、黄芩、炒苦杏仁、大豆黄卷、大枣、炒白术、茯苓、桔梗、防风、柴胡、阿胶、干姜、白芍、人参、六神曲(炒)、肉桂、麦冬、白蔹、蒲黄(炒)、人工麝香、水牛角浓缩粉、羚羊角、朱砂、雄黄等原料药材由被检验制药企业提供。硅藻土、分析纯无水乙醇、正己烷、乙酸乙酯和丙酮购于北京化学试剂公司。

2 方法与结果

2.1色谱条件 色谱柱：HP-INNOWAX毛细管色谱柱(0.25 mm ×30 m，0.25 μm)，柱温：110 ℃；进样口温度：200 ℃；FID检测器温度：230 ℃；载气：氮气，流速：1.8 mL·min-1，分流比10：1 ；进样量：1 μL。

2.2溶液的制备

2.2.1对照品溶液的制备 精密称取樟脑对照品10 mg，置于100 mL量瓶，加无水乙醇溶解并定容，摇匀。精密量取上述溶液1 mL，置50 mL量瓶中，加无水乙醇定容，制成每毫升含樟脑2 μg的溶液，作为对照品溶液。

2.2.2供试品溶液的制备 取本品重量差异项下的大蜜丸，剪碎，混匀，取约3.0 g，精密称定，再加入硅藻土2.0 g，研匀，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入无水乙醇15 mL，密塞，称定质量，冰浴超声处理(功率250 W，频率40 kHz)30 min，放冷，再称定质量，用无水乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3阴性对照溶液的制备 取经检验不含樟脑的冰片和其余原料药材，按处方和制法制得缺樟脑阴性对照，按“2.2.2”项下方法制成阴性对照溶液。

2.3方法学验证

2.3.1专属性实验 分别取对照品溶液、供试品溶液与缺樟脑阴性对照溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，牛黄清心丸(局方)在樟脑的保留时间处，无其他成分干扰，见图1。

2.3.2线性关系、检出限和定量限 精密称取对照品适量，制得系列浓度对照品溶液，进样测定，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，并进行线性回归，结果回归方程为Y=3.15X+4.22，r=0.998 9。樟脑在1.65～165 μg·mL-1内线性关系良好，精密量取对照品溶液适量，稀释至不同浓度，进样测定，测得检出限(信噪比3：1)为0.42 μg·mL-1，定量限(信噪比10：1)为1.60 μg·mL-1。

2.3.3精密度实验 精密吸取对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件，连续进样6次，测定樟脑峰面积，计算RSD值为0.52%(n=6)，表明仪器精密度良好。

2.3.4稳定性实验 取供试品溶液(编号：8434)，按“2.1”项下色谱条件，分别在0，1，2，4，8 h进样，测定樟脑峰面积，计算RSD值为0.57%(n= 6)，表明供试品溶液在8 h内稳定。

1.樟脑

图1缺樟脑阴性样品(A)、樟脑对照品(B)、牛黄清心丸(局方)(C)的GC色谱图

1.camphor

Fig.1GCchromatogramsofnegativesamplewithoutcamphor(A)，camphorreferencestandard(B)andNiuhuangqingxinpills(prescriptionofthebureau) (C)

2.3.5重复性实验 取同一批号样品(编号：8434)，按照“2.2.2”项下供试品溶液制备方法制备6份样品，按“2.1”项下色谱条件，测得樟脑含量的平均值为0.002%，RSD值为1.75%(n= 6)，表明方法重复性良好。

2.3.6回收率实验 取已知含量的样品(编号：8434)，剪碎，混匀，称取约1.5 g，再加入硅藻土1.0 g，研匀，置具塞锥形瓶中，分别精密加入浓度为0.03 mg·mL-1的樟脑对照品溶液各0.5，1.0，1.5 mL，再分别精密加入无水乙醇14.5，14.0，13.5 mL，从“密塞”起，按照“2.2.2”项下方法制备9份加样回收溶液(每个加样浓度制备3份)，按“2.1”项下色谱条件测定，计算回收率，结果见表1。

表1 樟脑加样回收实验结果

2.3.7样品测定结果 取9个厂家生产的牛黄清心丸(局方)38批次，依法测定，结果见表2。所有样品测定值趋于靠近0的偏态分布，频数分布图见图2，有6个厂家7批次样品检出微量樟脑，不同生产企业样品樟脑测定值箱式比较见图3。

表2 牛黄清心丸(局方)中樟脑含量

图2牛黄清心丸(局方)中樟脑测定值频数分布图

Fig.2FrequencydistributionplotofcamphorcontentinNiuhuangqingxinpills(prescriptionofthebureau)

3 讨论

笔者对提取方法进行优化，比较加入硅藻土和不同有机溶剂对提取效率的影响，结果显示加入硅藻土研磨有助于成分的溶出，无水乙醇提取效率高于正己烷、乙酸乙酯和丙酮。

《中华人民共和国药典》2015年版规定冰片“含樟脑不得超过0.50%”，按冰片药材每日最大服用量计算，樟脑的每日最大摄入量为1.5 mg，牛黄清心丸(局方)的用量为一次一丸(袋)，一日一次，每天最大服用剂量为3 g，故本品樟脑的拟定安全限度为0.050%，测定值均低于上述限度。研究还对牛黄清心丸(局方)中龙脑、异龙脑的含量行了测定，并计算樟脑在3种成分含量总和中所占比例，结果检出樟脑的样品，樟脑占总量的比例均大于冰片药材的限量0.50%，提示制药企业应严格控制冰片原料质量。

图3不同生产企业牛黄清心丸(局方)中樟脑测定值箱式比较图

Fig.3BoxplotofcamphorcontentinNiuhuangqingxinpills(prescriptionofthebureau)fromdifferentmanufactures