miRNA及其在肝细胞癌发生发展中作用的研究进展

李彦宁，王建华

(天津中医药大学附属北辰中医医院，天津300400)

肝细胞癌(HCC)是原发性肝癌的主要病理类型，发病率居全球恶性肿瘤第五位[1]。HCC具有发病隐匿的生物学特征，故临床多数患者确诊时已属晚期，临床治疗手段有限甚至无效。临床亟待新的治疗方法来改善HCC的预后。因此深入研究HCC发生发展的分子机制，探索HCC早期诊断的生物学标记物和药物治疗靶点是当前研究的热点。微小RNA(miRNA)是一类无翻译蛋白质功能的非编码RNA分子。近年研究发现，miRNA在HCC组织中呈异常表达，证实其在HCC的发生发展、浸润和转移等生物学过程中起重要作用，极有可能为未来早期诊断和治疗HCC提供新的理念和方向。miRNA

可影响肿瘤细胞分化、上皮-间质转化(EMT)、化疗敏感性及肿瘤转移，甚至可能标记HCC干细胞表型。揭示miRNA的作用和机制有助于进一步分析HCC的分子作用机制，为HCC提供潜在基因治疗靶点。

1 miRNA概述

miRNA是调节基因表达的一类重要短链非编码RNA，其主要通过调控转录后水平参与机体功能调节。miRNA通过其种子序列与mRNA的3'非翻译区(3'UTR)互补结合以介导mRNA去腺苷酸化或翻译阻断[2]。miRNA的基因调控在机体是普遍存在的，人类基因组编码中有超过1 000个miRNA，并且每个都可以调节多个靶标[3]。提示miRNA对众多生物过程有一定影响。

miRNA表达谱与HCC的相关性在过去十年中已被广泛研究。现已明确，人类HCC和非肿瘤性肝脏组织miRNA表达显著不同。部分miRNA例如miR-21、miR-221和miR-222在HCC组织中呈过表达状态。这些miRNA通过负调控HCC组织中抑制肿瘤的蛋白质编码基因来促进肿瘤发生发展[4～6]。以上致癌miRNA也被称为“oncomiRs”。另一方面，多项研究表明miR-122、miR-125b、miR-139、miR-101和let-7等在HCC组织中的表达周期性下调[7～10]。提示miRNA通过抑制HCC中的致癌基因发挥肿瘤抑制作用。miRNA调控紊乱是早期事件，可在癌前病变肝脏发育不良结节中检测到，并且可在HCC发生过程中进一步积累[11]。

目前HCC的具体发病机制尚不明确，探究miRNA与HCC发生发展的相关性可为揭示HCC的发病分子机制提供新的方向。根据miRNA在HCC中的生物学功能表现，可以将其分为抑制肿瘤和致肿瘤作用两类。

1.1 抑制HCC发生发展的miRNA 抗肿瘤miRNA通过多种途径抑制HCC的发生发展。Wang等[12]在进展期HCC小鼠模型中发现，Myc原癌基因蛋白(MYC)过表达导致miR-122表达下调。另有学者在HCC小鼠模型(敲除MYC)中发现腺相关病毒介导的miR-122过表达能够抑制肿瘤进展[13]。体外实验表明，miR-122通过直接靶向调控原癌基因Wnt-1参与Wnt信号通路传导，进一步破坏HepG2细胞中β-链蛋白的稳定性[14]。Hou等[15]研究表明，miR-199a-3p通过抑制p21活化激酶4及RAF-MEK-ERK途径下游分子表达在HCC中发挥调控作用。提示miRNA可通过调控某些原癌基因发挥抗肿瘤作用。miR-122可通过抑制M2型丙酮酸激酶(PKM2)表达以影响HCC细胞系中葡萄糖的代谢，并且miR-122过表达可降低葡萄糖摄取并逆转HCC细胞系中的Warburg效应[16]。miR-199a-5p可通过靶向调控己糖激酶2和PKM2来调节HCC中葡萄糖酵解代谢。进一步通过体内和体外研究发现，miR-199a-5p过表达可抑制HCC生长且阻断缺氧诱导的代谢变化[17,18]。提示miRNA可通过调控肿瘤细胞代谢抑制HCC发生发展。Fornari等研究表明miR-122通过靶向调控细胞周期蛋白G1而影响HCC细胞的细胞周期进程。进一步研究发现，miR-199a-3p在HCC细胞系中通过抑制雷帕霉素和肝细胞生长因子受体信号传导机制发挥调控作用，并且诱导细胞周期停滞和促进细胞凋亡[19]。NOD/SCID小鼠模型研究发现，miR-122*过表达诱导HepG2细胞中TP53依赖性细胞凋亡并抑制HCC致瘤性[20]。提示miRNA可通过调控肿瘤细胞周期、增殖和凋亡抑制HCC发生发展。

1.2 促进HCC发生发展的miRNA 在HCC组织中表达上调的miRNA亦可通过多种途径促进HCC发生发展。体外实验表明，miR-221通过调节肿瘤抑制基因人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因(PTEN)和组织金属蛋白酶抑制因子3促进HCC的发生和HCC细胞的迁移[21]。miR-21通过调节人肝细胞癌中肿瘤抑制基因PTEN的表达，促进HCC的进展[22]。提示miRNA可通过调控肿瘤抑制基因发挥促HCC的作用。miR-221通过组成型激活NF-κB通路促进HCC细胞的生长和侵袭[5]。Gramantieri等[23]研究发现，miR-221负向调控凋亡调节因子家族的促细胞凋亡蛋白BMF表达与肝肿瘤的多灶性转移相关。研究发现，在二乙基亚硝胺诱导的HCC大鼠模型中miR-221的过表达与索拉非尼耐药性相关，进一步研究发现miR-221可能通过调节Caspase-3的表达和细胞凋亡发挥作用[24]。提示miRNA可通过影响肿瘤细胞的增殖和凋亡发挥调控HCC的作用。现已明确，miR-221直接靶向调控周期蛋白依赖激酶抑制剂和细胞周期蛋白依赖激酶抑制因子1C促进了人HCC细胞系中细胞周期的进展。提示miRNA可通过调控细胞周期促进HCC发生发展。

2 miRNA对HCC发生发展的调控机制

2.1 miRNA在HBV相关HCC中的调控机制 HBV感染是HCC发生的主要危险因素，在世界范围内超过50%的HCC病例与HBV感染有关。目前研究已明确HBV直接参与驱动HCC发生的过程。第一，HBV病毒基因组可以整合到人类基因组中，导致基因组不稳定和致癌嵌合转录本的产生。第二，HBV蛋白X(HBx)具有高度致癌性，90%的HBx转基因小鼠可以发生HCC。Wang等[10]研究表明，导入HBx的HepG2细胞中miRNA表达发生了改变，对let-7家族miRNA表达下调的影响尤为显著。有研究表明HBx可以通过改变宿主中重要的转录因子或信号通路来介导miRNA的失调。例如HBx可通过调控TP53和MYC的表达分别抑制miR-148a和miR-16。HBx还可通过激活信号转导和转录激活因子3(STAT3)-IL-6途径上调致癌基因miR-21的表达[25]。

2.2 miRNA在HCV相关HCC中的调控机制 HCV感染是导致肝硬化和HCC的主要原因之一。HCV诱导HCC发展的分子机制可能与HBV感染具有差异性，其相关HCC组织中的miRNA可以调控免疫应答、细胞周期和代谢途径等。研究表明HCC发生过程中HCV与宿主miRNA之间存在复杂的相互作用。一方面，HCV感染实质上是改变宿主miRNA的表达以促进其病毒复制。目前研究表明，miR-122对HCV复制至关重要。miR-122通过与其5'UTR结合来稳定HCV RNA。此外，HCV RNA还可以从其内源mRNA靶标中螯合miR-122[26]。故HCV感染在功能上抑制miR-122及其靶标以诱导HCC发生。另一方面，miR-199a直接靶向调控HCV基因组的内部核糖体进入位点。miR-199a-3p过表达以RNA诱导沉默复合体依赖性机制抑制永生化肝细胞中的HCV病毒复制。干扰素β(IFN-β)通过调节宿主miRNA表达部分地发挥其抗病毒作用。IFN-β治疗通过下调miR-122表达并使HCV RNA不稳定[27]。同时IFN-β诱导miR-196、miR-296、miR-351、miR-431和miR-448的表达，这些miRNA直接靶向调控HCV RNA并减弱HCV复制[11]。

HCV通过上调宿主miRNA和促使细胞信号传导途径失调来促进HCC的形成。miR-155表达由HCV感染诱导，通过激活其上游转录因子(NF-κB和P300)，部分上调miR-155表达，从而促进细胞周期进程并抑制细胞凋亡。miR-155还通过靶向调控腺瘤性结肠息肉蛋白而激活Wnt信号传导调控Wnt靶基因的表达，包括细胞周期蛋白D1、MYC和存活蛋白。BALB/c裸鼠模型中，miR-155过表达促进HCC增殖和皮下肿瘤发展[28]。

2.3 miRNA在上皮-间质转化和肿瘤转移中的调控机制 癌症转移是癌症患者病死率高的原因。目前研究表明miRNA参与了HCC转移。体外和体内研究均证实，miR-124、miR-139和miR-151等发挥抑制癌细胞运动和侵袭的作用[29]。肿瘤抑制miRNA(miR-17和miR-29b)是基质金属蛋白酶(MMP)的负向调节因子，MMP是癌症转移过程中消化细胞外基质蛋白的关键酶。miR-200家族，miR-216和miR-181a与人类HCC中转化生长因子β(TGF-β)介导的EMT有关。研究表明miR-200家族因子通过形成具有E盒锌指结合蛋白1(ZEB1)和E盒锌指结合蛋白2(ZEB2)的双负反馈环路，在HCC中调控EMT。因此，miR-200家族表达下调增强了ZEB1和ZEB2的表达，从而抑制E-钙黏蛋白的表达以促进EMT[30]。除了调节癌细胞转移过程之外，miRNA还调节肿瘤微环境中的免疫细胞以促进播散的HCC细胞的定植。TGF-β可下调HCC细胞系中的miR-34a表达，从而增加CCL22产生和招募CD4+CD25+调节性T细胞到肿瘤微环境[11]。Zhou等[31]通过对小鼠异种移植模型研究发现，HCC中miR-28-5p表达下调可以促进IL-34介导的肿瘤相关巨噬细胞(TAM)浸润。TAM浸润通过分泌TGF-β进一步抑制miR-28-5p的表达，从而形成调节HCC转移的前馈环。

2.4 miRNA对HCC干细胞的调控机制 癌症干细胞(CSC)是具有类似于正常干细胞特征的肿瘤内罕见细胞群。众多研究表明CSC对癌症的耐药性、肿瘤复发和转移具有重要影响，故CSC成为治疗癌症的潜在靶点，并通过多种方法研究调节CSC功能的分子机制[32]。单细胞克隆HCC干细胞(LCSC)和非LCSC中基因表达的分析研究已经鉴定出导致HCC具有干性表型的miRNA。

CD133被广泛认为是LCSC表面标记物。CD133+HCC细胞较CD133-HCC细胞在体内具有更高的集落形成能力、扩散能力和致肿瘤能力。差异miRNA表达谱分析表明miR-130b在CD133+LCSCs中呈过表达状态，并且miR-130增强了HCC细胞系和肿瘤异种移植物的肿瘤干性表型，表现为化学抗性、致肿瘤性和自我更新能力的增强[33]。上皮细胞黏附分子(EPCAM)是另一种常用的LCSC标记物。miRNA表达谱分析研究表明，人HCC样本中分离的EPCAM+LCSC中富含miR-181、miR-429、miR-150、miR-155和miR-223。这些miRNA通过靶向调控关键转录调节因子和信号分子来促进HCC细胞干性的表达[34]。

miRNA作为参与调节多种生物和细胞过程的重要调节因子，不同类型的miRNA表达失调与HCC的发生发展密切相关。了解miRNA在人HCC发生发展中作用，对揭示肝癌发生的分子机制有重要价值。