炮制-配伍对理中丸方水煎液指纹图谱影响研究△

张姗姗，姚梦雪，洪燕，韩燕全，汪小莉

1.安徽中医药大学，安徽 合肥 230031；2.安徽中医药大学第一附属医院/国家中医药管理局中药制剂三级实验室，安徽 合肥 230031

中药炮制是在中医药理论的基础上，根据用药的需求和药物本身的性质所采取的一项制药技术，是中医药学的一大特色。中药所含的有效成分是其治疗疾病的化学物质基础，经过炮制-配伍其内在的物质基础发生了一定的改变，复方的疗效也会受到影响，所以在复方中研究炮制更符合实际。

理中丸出自东汉张仲景所著汉医经典著作《伤寒论》，具有温中散寒、益气健脾之功能，临床应用广泛，是疗效确切的中医经典方剂。本实验所采用的理中丸按照2015版《中华人民共和国药典》[1]所记载方法，分别采用4味生制饮片和4味炮制饮片(其中党参为米炒党参，甘草为蜜制甘草，白术为土白术，姜为炮姜)组成炮制-配伍的组方。实验前期发现，单味姜炮制前后指纹图谱差异明显，而本实验在此基础上拟从复方的角度研究以姜为君药的理中丸方炮制-配伍前后指纹图谱的差异[2-4]，以期为中药临床选择合适炮制品提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

超高效液相色谱仪(美国Waters Acquity H-Class，UPLC)，包括四元梯度泵自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器以及Empower 2工作站；ME55型十万分之一分析天平[梅特勒-托利(上海)有限公司]；KQ3200DB型超声仪(江苏昆山超声仪器有限公司)；0.2 μm微孔滤膜(上海陆纳生物科技有限公司)。

1.2 试药

甘草苷(551-15-5)、甘草酸单铵盐(53956-04-0)、甘草素(578-86-9)、甘草次酸(471-53-4)、6-姜酚(13012303)、6-姜烯酚(12121803)、8-姜酚(13070101)、白术内酯Ⅲ(16032203)、党参炔苷(16062207)购于成都曼思特生物科技有限公司，经1H-NMR、13C-NMR、UV、IR和MS等光谱检测确认其结构；甲醇、乙腈、磷酸为色谱纯；水为屈臣氏纯净水。

党参、甘草、白术、姜由安徽省中医院中药房提供，经安徽中医药大学第一附属医院李立华主任中药师鉴定符合2015版《中华人民共和国药典》项下性状鉴别规定。

2 方法与结果

2.1 样品制备

2.1.1 炮制品制备 取姜、甘草、白术和党参分别按照《中华人民共和国药典》2015版附录项下砂烫法、蜜制法、土炒法和米炒法，制备得到炮姜、炙甘草、土白术和米党参。

2.1.2 样品提取 按照《中华人民共和国药典》2015版理中丸组方比例，分别取党参7.5 g、甘草9 g、姜5 g和白术7.5 g进行配伍；将配好的理中丸方药材加入10倍量水浸泡30 min，武火煮开后，改之文火煎煮40 min，过滤；药渣再加8倍量水武火煮开后，文火煎煮30 min，过滤。合并滤液，浓缩，放冷后定容至20 mL，重复制备过程，共得10批理中丸(生品)水煎液[下文均称理中丸(生)]；将组方中的姜、甘草、白术和党参分别替换成等量的炮姜、炙甘草、土白术和米党参。重复以上制备过程，得到10批理中丸(炮制品)水煎液[(下文均称理中丸(炮)]。

2.2 色谱条件

Waters Acquity BEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；柱温：30 ℃；以乙腈为流动相A，0.1%磷酸水溶液为流动相B，进行梯度洗脱，程序为0～1.5 min，3%A；1.5～10 min，15%A；10～14 min，30%A；14～16.5 min，55%A；16.5～19 min，70%A；19～20 min，3%A；检测波长：237 nm；流速：0.2 mL·min-1[5]。

2.3 对照品溶液的制备

取甘草苷、党参炔苷、甘草素、甘草酸铵、甘草次酸、6-姜酚、白术内酯Ⅲ、8-姜酚、6-姜烯酚对照品适量，精密称定，配置成各对照品母液；再取一定量对照品母液，加甲醇制成每mL分别含甘草苷0.021 mg、党参炔苷0.023 mg、甘草素0.002 17 mg、甘草酸铵0.012 mg、甘草次酸0.007 8 mg、6-姜酚0.007 8 mg、白术内酯Ⅲ0.006 68 mg、8-姜酚0.000 552 8 mg、6-姜烯酚0.001 6 mg的混合对照品溶液。

2.4 供试品溶液的制备

分别取10批理中丸方生品与10批理中方炮制品水煎液各1 mL，水提液加甲醇定容至10 mL，震荡、混匀、静置。取上清液于12 000 r·min-1离心10 min，上清液过0.2 μm滤膜供UPLC分析用。

2.5 方法学考察

2.5.1 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液1 μL，在2.2色谱条件下重复进样6次。各主要色谱峰保留时间和峰面积基本一致，在同一台仪器测得的色谱指纹图谱与其共有模式图谱的相似度大于0.997，符合指纹图谱的要求，表明仪器精密度良好。

2.5.2 重复性试验 取6份理中丸(炮)处方生制饮片，按照2.4供试品的制备项下方法制备供试品溶液，按2.2项下色谱条件，分别进样，考察各份样品色谱峰保留时间的一致性，并采用“中药色谱指纹图谱相似度评价软件2004(A版)”计算其相似度，结果表明6份理中丸(炮)制品相似度均大于0.994，符合指纹图谱的要求。

2.5.3 稳定性试验 精密吸取理中丸方(炮)水煎液样品溶液1 μL，在2.2项色谱条件下，分别在0、4、8、12、16、24 h进样，以选定的色谱峰为观测指标，各主要色谱峰保留时间和峰面积基本一致，6个时间点的指纹图谱相似度大于0.997，表明在24 h内理中丸方(炮)水煎液的稳定性良好。

2.5.4 理中丸方水煎液指纹图谱中的共有峰 取20批理中丸水煎液供试品溶液，按2.2项方法下依次进样检测，根据指纹图谱的检测结果，利用“中药色谱指纹图谱相似度评价软件2004(A版)”，生成理中丸方水煎液共有峰指纹图谱，其中共有色谱峰16个；通过与混合对照品进行比对，指认了其中9个特征峰，分别为甘草苷(6)、党参炔苷(7)、甘草素(9)、甘草酸铵(10)、甘草次酸(12)、6-姜酚(13)、白术内酯Ⅲ(14)、8-姜酚(15)、6-姜烯酚(16)，理中丸方水煎液共有峰指纹图谱和混合对照品图谱见图1。

注：a.理中丸方水煎液共有峰指纹图谱；b.混合对照品图谱。图1 理中丸方水煎液对照图谱和混合对照品图谱

2.5.5 理中丸方水煎液指纹图谱相似度评价 将所得的20批理中丸方水煎液UPLC图以AIA格式依次导入“中药色谱指纹图谱相似度评价软件2004(A版)”，得到指纹图谱叠加图，见图2，分别比较了20批理中丸方水煎液样品的色谱图，并计算得到20批样品的相似度[6-7]，见表1。

注：S1～S10.理中丸(生)；S11～S20.理中丸(炮)。图2 理中丸(生)液与理中丸(炮)各10批叠加指纹图谱

表1 理中丸方水煎液相似度

2.5.6 理中丸方(生、炮)水煎液指纹图谱相对保留时间与相对峰面积 对10批理中丸方(生)和10批理中丸方(炮)水煎液进行指纹图谱分析，生品与炮制品水煎液指纹图谱的相对保留时间基本一致，符合程度好，而相对峰面积变化较大，可见炮制-配伍对理中丸方指纹图谱影响较大，结果见表2～5。从图2可见，6号峰的峰面积较大，保留时间居中，是含量较高的主要指标成分甘草苷，所以选择6号峰为参照峰，进行相对保留时间和峰面积计算。

表2 理中丸(生)水煎液相对保留时间

注：RRT为平均相对保留时间。

表3 理中丸(炮)水煎液相对保留时间

注：RRT为平均相对保留时间。

表4 10批理中丸(生)水煎液指纹图谱相对峰面积

注：RPA为平均相对保留峰面积。

表5 10批理中丸(炮)水煎液指纹图谱相对峰面积

续表5

注：RPA为平均相对保留峰面积。

2.5.7 样品的聚类分析 以峰面积为变量，采用SIMCA 13.0.3软件对20批理中丸水煎液进行聚类分析，理中丸方生品水煎液S(1～10)聚为一类，理中丸方炮制品P(1～10)聚为一类，表明炮制-配伍前后理中丸内在质量差异明显。结果见图3。

注：S.理中丸(生)；P.理中丸(炮)。

2.5.8 样品的主成分分析 采用SIMCA 13.0.3软件对20批理中丸水煎液进行主成分分析，分析结果见图4，PCA二维投影图可见S1～S10距离相近，P1～P10距离相近，分别相聚成群，图中每个点代表一个理中丸水煎剂样品，20批样品的PCA图可分明显为2类，结果与聚类分析相互印证，表明炮制-配伍前后理中丸内在质量差异明显。

注：S.理中丸(生)；P.理中丸(炮)。

如图5所示，PLS-DA分析各色谱峰的VIP得分图表明，色谱峰变量对样品分类的影响大小排序为F3>F1>F15>F2>F5>F9>F16>F11>F8>F13>F10>F6>F12>F7>F14>F4，其中VIP值大于1的色谱峰有7个，分别为F3、F1、F15、F2、F5、F9、F16，其中F9(甘草素)、F15(8-姜酚)、F16(6-姜稀酚)为指认的共有峰，也进一步说明炮制-配伍对理中丸水煎液的质量有影响，其他成分色谱峰对其影响有待进一步探索。

图5 各色谱峰变量投影重要性分析得分图

3 讨论

中药指纹图谱能够较好地体现中药成分的复杂性和相关性，是研究中药整体特征的一种有效方法，在国内外应用越来越多[8-9]。本实验采用水煎煮法分别制备10批理中丸(生品)水煎液和10批理中丸(炮制品)水煎液，采用UPLC法对炮制-配伍前后理中丸方水煎液指纹图谱进行分析，寻找生品和炮制品组方前后的总体化学成分差异[13]。因为理中丸方最初以汤剂的形式应用于临床，为了使样品的提取方法与传统煎剂相符，所以在实验中采用水煎剂法进行样品提取；由于水煎剂中的杂质较多，所以选择甲醇为溶剂进行沉淀以精制样品。实验对样品的指纹图谱进行了全波长扫描，分别比较了波长为237、254、267、280 nm的色谱图，发现在237 nm波长处检测出图谱信息量较多，且峰形较好，最终确定了此波长。同时，实验考察了不同流动相系统、梯度洗脱条件、柱温条件和不同型号色谱柱对指纹图谱的影响，经过优化，最终以乙腈-0.1%磷酸水作为流动相，柱温为30 ℃，色谱柱为Acquity BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)，此条件下各色谱峰的分离度较好，且基线平稳，峰形较好，有利于样品的测定和分析。

本实验对炮制-配伍前后理中丸指纹图谱进行了初步的研究，通过比较炮制配伍前后理中丸生品与炮制品的色谱峰的峰面积和色谱图的直观观察可知，炮制-配伍前后各色谱峰大小差异明显。经炮制后，色谱峰1、2、3等7个色谱峰的峰面积增加，可能是炮制后这些成分容易煎出；而色谱峰6、7、8等9个色谱峰的峰面积减少，推测理中丸生品经炮制后部分成分含量减少。理中丸生品经炮制后其成分含量有增有减，说明炮制-配伍对理中丸水煎液指标成分产生了影响，实验结果表明，炮制-配伍对复方的物质基础有影响，而复方的物质基础可以直接影响方剂的临床疗效，但是，要阐明炮制-配伍前后复方成分的变化机理还需要结合质谱分析和药效学等手段进行进一步的研究。