免疫炎症与糖尿病肾病

黄 力 综述 葛永纯 审校

糖尿病在全球的发病率逐年升高［1］，糖尿病肾病(DN)正逐渐成为最常见的继发性肾脏疾病，主要表现为持续性蛋白尿伴血压升高，肾小球滤过率下降，伴随心血管事件发生风险和死亡率增加，也是导致终末期肾病的主要病因。然而，目前DN的发病机制尚未完全阐明，尽管DN并非免疫复合物介导的肾脏疾病，但越来越多的研究证实免疫与炎症反应在DN发生和发展过程中发挥重要作用，本文就免疫与炎症反应参与DN的机制研究进展进行综述。

固有免疫应答

参与DN的免疫反应主要为固有免疫应答［2］，高糖导致细胞内线粒体和内质网功能异常、活性氧(ROS)产生增加，细胞内信号通路异常活化，进而导致细胞应激和功能损伤。糖尿病应激状态下，肾脏固有细胞产生促炎症反应，通过释放化学趋化因子、细胞黏附分子和损伤危险相关分子模式(DAMPs)促进固有免疫应答，募集巨噬细胞。通过活化补体和募集细胞因子，放大固有免疫应答，促进炎症细胞和肥大细胞的肾组织浸润。随着DN进展，肾脏对缺血更加敏感，肾组织中性粒细胞和巨噬细胞浸润加剧。这些免疫反应促进DN肾脏损伤和肾功能下降。因此，复杂的固有免疫应答与炎症反应参与DN的发生与发展。

单核巨噬细胞和肥大细胞 巨噬细胞是DN肾组织中最常见的浸润细胞，且与肾功能下降有关。对1型和2型DN动物模型的分析表明，90%的浸润细胞为表达CD68+的巨噬细胞，主要来自单核细胞募集或局部增殖［3］。集落刺激因子(CFS-1)对单核巨噬细胞起到促增殖、分化作用。通过中和抗CSF-1受体(c-fms)的抗体，减少肾脏单核巨噬细胞浸润可改善DN［4］。在DN动物模型和DN患者的肾活检组织中发现，在DN早期，肾小球与间质中存在巨噬细胞积聚和活化，其主要聚积在发生损伤的肾小管，如小管扩张、萎缩和凋亡细胞周围［5］，并与患者血清肌酐、蛋白尿水平和肾小球硬化、间质纤维化成明显正相关，巨噬细胞的浸润、募集和活化可导致大量炎性因子、促纤维化因子和抗血管生成因子的生成与释放，如肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1(IL-1)、IL-6、转化生长因子 β(TGF-β)、血管内皮生长因子(VEGF)等，与肾脏固有细胞相互作用，通过多种信号途径或蛋白，共同参与DN免疫炎性损伤的发病机制，如丝裂原活化蛋白激酶/核因子κB(MAPK/NF-κB)、Toll样受体(TLR)等。Chow 等［6］发现ICAM-1敲除后，减少巨噬细胞在肾脏中积聚的同时，可明显减轻DN小鼠白蛋白尿和小管间质损伤。也可以通过改变浸润巨噬细胞的表型来减少组织损伤，肾脏浸润巨噬细胞主要为M1促炎表型。有研究表明，在具有COX-2缺陷的小鼠中，巨噬细胞M1表型与DN有相关性。这些小鼠DN病变更严重，并伴M1表型巨噬细胞增多，提示COX-2促进巨噬细胞组织修复M2表型［7］。因此，降低巨噬细胞M1表型、促进M2表型的具有治疗DN的潜力。

有证据表明，肥大细胞作为固有免疫细胞，同样参与DN进展。肥大细胞脱粒释放许多炎症介质，如细胞因子、内皮素、TGF-β、胃促胰酶、类胰蛋白酶和其他蛋白水解酶［8］，这些介质可促进肾纤维化的发生发展。肥大细胞还可通过产生肾素影响肾脏肾素血管紧张素系统和糜蛋白酶。在将血管紧张素Ⅰ转化为血管紧张素Ⅱ时，肥大细胞胃促胰酶的效力比血管紧张素转换酶高40倍［9］。在DN动物模型中，与血管紧张素转换酶抑制剂治疗相比，抑制胃促胰酶可以更有效地减少肾血管紧张素Ⅱ和白蛋白尿［10］。

模式识别受体 固有免疫细胞不表达类似于T细胞表面受体的特异性抗原识别受体，固有免疫识别受体模式分为病原体相关分子模式(PAMP)和DAMPS。识别PAMP和DAMP的专一性受体，称为模式识别受体(PRR)，其中包括TLR、NOD样受体(NLR)、C型凝集素受体(CLR)等。NLRs中的代表性分子 NLRP3形成的炎症小体［11］，可被很多PAMP的成分激活，如尿酸、细胞外的三磷酸腺苷(ATP)、二氧化硅、高血糖和血清淀粉样A物质(SAA)，最终激活半胱天冬酶1(Caspase-1)，使得参与炎症反应的细胞因子(IL1-β、IL-18)激活。有研究证实，DN患者内皮细胞和足细胞存在NLRP3的活化，肾 小 球 NLPR3、casepase-1、IL-1β 和 IL-18mRNA高表达，阻断IL-1和炎症信号通路可以改善DN［12］。DN患者高表达TLR2和TLR4，是正常对照和微小病变肾病患者的4～10倍。肾小管间质高表达TLR4与巨噬细胞浸润密切相关。对微量白蛋白尿的DN患者随访6年，单因素分析显示肾小球TLR4高表达与肾小球滤过率(GFR)下降具有相关性［13］。

补体激活 补体系统是先天免疫系统的重要组成部分，其促进炎症并增强抗体和吞噬细胞清除病原微生物和受损细胞的能力。肾活检的转录组和免疫组织化学分析发现，50%～60%的DN患者肾小球有补体成分C3沉积，这与肾小球硬化的严重程度相关［14］。肾小球C3沉积也是DN动物模型的特征［15］。抑制补体C5减少了2型糖尿病大鼠的白蛋白尿和系膜扩张;阻断补体C3a受体可减少肾脏炎症、白蛋白尿，延缓 DN大鼠纤维化和肾功能丧失［16］，表明补体系统活化参与了DN的发生发展。

炎症细胞因子和黏附分子 在糖尿病肾脏中观察到的许多促炎反应涉及核因子κB(NF-κB)的激活。各种信号通过降解 NF-κB抑制因子激酶(inhibitor of NF-κB kinase，IKK) 的 方 式 来 活 化NF-κB，活化的NF-κB进入细胞核内与DNA结合以诱导促炎靶基因(细胞因子、趋化因子、白细胞粘附分子、细胞受体和生长因子)的转录。糖尿病患者肾组织肾小管间质基因表达谱鉴定显示有54种NF-κB靶基因上调，并伴随趋化因子的增多［17］。研究表明，NF-κB活化可刺激糖尿病肾脏中巨噬细胞的募集和炎性细胞因子［单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)，TNF-α，IL-1β 和 IL-6］的产生，与疾病的进展相关。除了NF-κB的激活之外，在DN患者和动物模型还发现了 p38MAPK，JNK，PKC，JAK/STAT等通路的显著活化，每一个通路在糖尿病炎症反应中均起到重要的作用。

TNF-α是一种重要的促炎细胞因子，是急性期反应的一部分。TNF-α主要由巨噬细胞和单核细胞产生，但在DN模型的肾小球和近端肾小管上皮细胞中显示TNF-α 表达水平增加［18］。通过 NF-κB 信号传导，TNF-α可以诱导细胞因子的转录，从而影响细胞的存活、增殖和黏附，促进炎症反应和细胞凋亡。TNF-α也与DN早期肾脏肥大和肾小球高滤过的发生有关［13］。在 DN模型的肾小球和近端肾小管上皮细胞中显示TNF表达增加，并且先于尿白蛋白排泄增加。C-C趋化因子2(CCL2)，也称为MCP-1，介导单核细胞和巨噬细胞向肾组织的迁移。CCL2 mRNA及其蛋白质在DN患者的肾小管间质中显着增加。大量蛋白尿和肾小管间质病变较重的患者尿中CCL2排泄量显著增加。在2型糖尿病患者中，尿CCL2排泄与肾病严重程度相关［19］。C-C趋化因子受体2(CCR-2)，不仅由单核/巨噬细胞表达，而且由分化的足细胞表达。在敲除CCR-2的模型中肾巨噬细胞/单核细胞浸润和间质纤维化减少［20］。血管细胞黏附分子1(VCAM-1)在内皮细胞和实验性DN的肾小管间质中的浸润细胞中显著上调，2型糖尿病患者血清VCAM-1水平显著升高，VCAM-1水平与白蛋白尿程度相关［21］。糖尿病动物模型的肾组织中IL-1水平升高，其表达水平与白蛋白尿的严重程度相关［22］。糖尿病患者肾脏间质细胞、足细胞、肾小管上皮细胞和间质中的浸润细胞IL-6 mRNA表达增加，并与DN的形态学变化如肾小球基膜(GBM)增厚相关［23］。糖尿病患者肾小管上皮细胞中IL-18的表达显着增加，并且这种过表达是由TGF-β诱导的MAPK通路诱导介导的［24］。IL-18作为可用的生物标志物，在糖尿病患者的血液及尿液中均显著增加［18］。在2型糖尿病患者中，IL-18的血清和尿液水平与白蛋白尿程度相关，血清IL-18水平升高预示白蛋白尿增加的风险更高，肾功能下降更快。

适应性免疫

适应性免疫系统的组成细胞包括辅助性(CD4+)T细胞，细胞毒性 (CD8+)T细胞和B细胞。糖尿病患者肾病的发展与循环T细胞的活化和肾脏中T细胞和CCL5增加有关［25］。DN动物模型的研究显示，肾组织T细胞数量轻度增加，主要存在于间质中，由CD4+、CD8+T细胞和少量调节性T细胞(Treg)组成［26］。一项13例2型糖尿病患者的研究发现肾脏间质CD4+和CD8+T细胞增加了6～10倍［25］。另一项研究中，缺乏成熟T和B淋巴细胞的Rag1－/－小鼠用链脲佐菌素诱导糖尿病，与具有同等糖尿病和浸润性T细胞的野生型对照相比，有类似的组织学损伤和肾功能的丧失，但糖尿病Rag1－/－小鼠白蛋白尿减少，表明T或B细胞促进了白蛋白尿的发展［27］。在不同的细胞因子及微环境刺激下，CD4+T细胞可分化成不同的亚型，如Th1、Th2、Th9、Th17、Treg。并非所有的 T 细胞活化都加重DN，Treg可诱导巨噬细胞分化成抗炎的表型［26］。研究表明，用抗CD25单克隆抗体耗尽Treg细胞可加重糖尿病小鼠肾损伤。这一单抗在糖尿病早期开始，可以促进胰岛素抵抗，Treg对DN发展的影响很大程度上取决于其对2型糖尿病的影响［28］。

B细胞在DN发生发展中的研究更加有限。在小鼠模型、DN患者的肾间质中也可观察到CD20阳性的浸润细胞，并与蛋白尿的数量相关［25］。

血清淀粉样A物质(SAA)

SAA是一种炎症急性期反应蛋白，具有促炎症作用。肾脏局部SAA主要由肾小球系膜细胞、足细胞和肾小管上皮细胞产生，终末糖基化产物(AGE)可刺激体外培养的足细胞产生SAA。SAA在DN发病过程中发挥重要作用。糖尿病肾脏患者和大鼠模型中，免疫组化染色可见SAA蛋白在肾小球和小管间质广泛的沉积［29］。SAA与足细胞炎症损伤的关系结果显示DN患者血浆SAA显著升高，并且其升高程度与尿蛋白正相关，与eGFR下降速率负相关［30］。近期研究同样发现，SAA的水平不仅与晚期DN患者死亡率和进展至ESRD密切相关，同样还可以预测早期DN患者和糖尿病患者进展至ESRD的风险［31］。Anderberg等［30］等观察发现 1 型 DN 大鼠模型、2型DN小鼠模型和DN患者血浆SAA水平较对照组显著升高、肾组织中有更高的信使RNA转录，以及肾小球与小管间质大量SAA蛋白的沉积。体外试验中重组的SAA可诱导足细胞炎性物质的基因转录，大量与NF-κB活化和炎症反应相关的基因被上调，进而产生大量炎性因子和趋化因子，包括内源性的SAA。以上研究证实足细胞是SAA介导肾脏炎症反应的最主要效应细胞，SAA通过上调NF-κB信号通路及其下游靶基因促进足细胞炎症反应。

很多的研究表明，在糖尿病足细胞损伤中，氧化应激的表观遗传修饰起重要作用。在体内，组蛋白甲基化受甲基化酶和去甲基化酶的双重调控，处于相对稳定状态。而疾病状态下，这种稳态被打破，H3K27me3的水平变化可以影响足细胞功能。Siddiqi等［32］研究发现组蛋白甲基化酶EZH2通过上调H3K27me3的水平，抑制转录因子Pax6基因，控制抗氧化抑制剂TXNIP表达，在糖尿病状态下，下调EZH2促进氧化应激损伤足细胞。在巨噬细胞研究中发现［33］，SAA的启动子区域受 H3K27ME3调控，在SAA刺激后的小鼠骨髓巨噬细胞、腹膜巨噬细胞和巨噬细胞系RAW264.7中，组蛋白H3K27去甲基化酶Jmjd3显著上调。SAA诱导Jmjd3表达伴随着细胞内组蛋白H3K27me3表达水平的下调。在小鼠巨噬细胞系RAW264.7中，当Jmjd3基因被沉默或过表达无活性的Jmjd3突变蛋白时，SAA诱导促炎基因如 IL-23p19，G-CSF，TREM-1等表达过程受到明显抑制，并伴随着启动子区H3K27me3甲基化水平的上调。小鼠体内实验［34］进一步证明Jmjd3基因沉默可抑制SAA诱导腹腔巨噬细胞促炎基因的表达，并下调由SAA引起的中性粒细胞增多。此外，Jmjd3在SAA诱导的巨噬细胞泡沫化形成中起到重要作用。研究阐明了一条依赖于Jmjd3调控的SAA诱导促炎细胞因子表达的信号通路。

在糖尿病足细胞损伤过程中，SAA可在足细胞内上调NF-κB信号通路及其下游靶基因表达炎性反应的产物，这一过程是否同样受到表观遗传学的调控尚不明确。因此，有必要进一步研究在糖尿病状态下SAA的升高对足细胞内组蛋白去甲基化酶Jmjd3和H3K27me3水平及下游系列靶基因和产物的影响，阻断此通路能否逆转足细胞损伤，有助于我们寻找新的干预靶点，开启DN治疗的新时代。

小结:DN正逐渐成为我国最常见的继发性肾脏疾病之一，越来越多的研究证实免疫与炎症反应在DN发生和发展过程中发挥重要作用。糖尿病应激状态下，肾脏固有细胞通过DAMPs识别内源性损伤，可募集巨噬细胞、肥大细胞等固有免疫细胞，通过 NF-κB、JNK、PKC、JAK/STAT 等通路活化补体和募集细胞因子、黏附分子。SAA可能通过对足细胞内组蛋白去甲基化酶Jmjd3和H3K27me3水平的表观调控影响靶基因表达炎性产物，引起糖尿病足细胞损伤，从而在DN发病过程中发挥重要作用。