外泌体及其microRNA与缺血性脑卒中关系的研究进展

胡琳，何圣佳，陈翠花，邹利，孙延鹏，王云甫

(1湖北医药学院第一临床学院，湖北十堰442000；2湖北医药学院附属十堰市太和医院)

脑卒中已成为人类病死率和致残率最高的疾病，其中80%～90%脑卒中为缺血性脑卒中[1]。脑缺血再灌注损伤(CIRI)是指脑组织缺血导致细胞损伤，恢复血流再灌注后，脑细胞损伤进一步加重，具体机制可能与再灌注时氧自由基通过脂质过氧化、蛋白质变性、线粒体凋亡以及死亡受体的激活等相关，该类损伤可进一步导致脑组织损伤加重和神经功能障碍，甚至神经细胞死亡。发现不同阶段新型特异损伤标志物[2]，调控和修复受损的神经细胞以及促进脑血管再生，成为目前诊疗的重要突破口。外泌体是一种特异性细胞外囊泡，其表面蛋白分子及其内的外泌体是大多数细胞分泌到细胞外的一种膜性囊泡，直径40～100 nm，通过其表面特殊分子热休克蛋白(HSP70)、Alix、白细胞分化抗原68(CD68)及内部蛋白、微小RNA(microRNA)、长链非编码RNA(lncRNA)、DNA等发挥细胞间信息交流、靶向运输、调控靶细胞功能等重要作用[3]。近年来越来越多的研究表明，细胞在不同应激状态下分泌的外泌体有其特征及作用，并可作为损伤标志物动态评价CIRI[4]。外泌体本身作为可靠有效的载体，实现了药物的靶向递送，并参与了脑血管损伤修复，进而减轻CIRI，同时外泌体内的microRNA、lncRNA也参与调节靶细胞[5,6]。目前其在心脑血管疾病中作为损伤标志物、药物靶向治疗载体、调节受损细胞功能等方面作用显著，同时也有研究发现外泌体携带的microRNA可以作为组织缺血不同阶段的新型标志物。本文对外泌体及其microRNA在缺血性脑卒中发生发展、治疗中的作用作一综述。

1 外泌体与缺血性脑卒中的关系

1.1 外泌体与脑血管修复、再生的关系 CIRI过程中由于血管通透性改变导致局部白细胞游走渗出，局部炎症反应将进一步加重脑组织损伤。近年来CIRI后脑血管修复、再生成为研究热点。体内外相关实验证实内皮祖细胞能够分泌参与磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路相关microRNA的外泌体，亦能够分泌参与前血管生成的microRNA外泌体，如miR-126和miR-296，从而使内皮细胞通过激活PI3K/Akt信号通路参与内皮细胞的修复与再生[7,8]。Xu等[9]发现，神经元通过分泌含有miR-132的外泌体作用于血管内皮细胞中Eef2k基因，通过抑制Eef2k基因的表达从而上调Cdh5分子表达，增强了血管完整性。胶质母细胞瘤来源的外泌体通过释放前血管生成蛋白、mRNAs、microRNAs，作用于血管内皮细胞，从而调节受损的血管内皮细胞，同样其在CIRI过程中也发挥相同的作用。除此之外，血管内皮细胞在应激状态时会释放含有血管内皮生长因子B(VEGF-B)mRNA的外泌体，而后外泌体被已经受损的血管内皮细胞内吞，增强受损的血管内皮细胞中VEGF表达，最终修复了受损的内皮细胞[10]，促进血管修复。在心肌缺血再灌注损伤的研究中发现，外泌体内miR-223-3p通过调节核糖体蛋白S6激酶Β1/氧诱导因子1α信号通路抑制了心脏微血管内皮细胞修复[11]，这一现象在脑缺血的过程中如果同样存在，将具有重要意义，具体机制值得进一步研究[7,12]。

脑卒中发生后，缺血半暗带的面积大小与脑血管的完整性存在一定关联。减小缺血半暗带面积及修复损伤血管对脑卒中的复发及患者预后发挥重要作用。越来越多的研究发现，神经元及血管内皮细胞来源的外泌体中microRNA对受损血管结构的调节及血管修复发挥重要作用；外泌体参与CIRI后血管修复和再生，其涉及的机制比较复杂，有待进一步研究证实。

1.2 外泌体与神经修复、再生的关系 室管膜下的神经干细胞与周围神经细胞及与血管内皮细胞之间的交流使得其内信号通路的激活处于持续动态变化之中，有向各种细胞分化的趋势，于是越来越多的研究趋向于研究室管膜下的神经干细胞不同分化方向的信号通路[13]。研究表明，神经胶质细胞来源的外泌体及脑脊液内的外泌体通过调控神经干细胞内的信号通路，从而参与调节神经细胞的功能及免疫反应[14]。通过分析大鼠及人脑脊液外泌体发现，该类外泌体内含有胰岛素样生长因子信号通路中关键的蛋白和相关microRNA，此类外泌体调控神经干细胞向神经元细胞的分化，这一潜在的机制将为临床诊疗带来新思路[14]。此发现将为脑缺血发生后诱导神经干细胞分化为神经元细胞进而替代死亡的神经元细胞提供了新思路。又有研究发现，利用促炎性细胞因子体外刺激神经干细胞，可促进神经干细胞分泌富含microRNA的外泌体，通过作用血管内皮细胞的靶基因，上调了γ-干扰素的水平，进一步激活信号转导与转录激活子信号通路，减轻炎症反应，改善了受损神经元细胞的活性[15]。脑缺血时离子型谷氨酸受体(NMDA)的过表达可加重神经元损伤[16]。研究表明，外泌体中的miR-233调控NMDA亚基的功能亚单位GluR2和NR2B3′-UTR基因的表达，其通过作用GluR2和NR2B基因3′-UTR的操纵序列而抑制GluR2和NR2B基因表达，进一步抑制NMDA的受体表达，可减少NMDA所介导的Ca2+内流。由此推断，上调miR-233表达可以抑制NMDA的表达，阻止Ca2+过度内流，从而减轻细胞内Ca2+超载所引发的神经元损伤，进一步减轻缺血区域神经元细胞损伤[17]。因此缺血事件发生后，外泌体内microRNA对神经细胞的修复以及神经元细胞再生有重要意义[18]。

大脑对缺血缺氧的耐受能力较差，在相应的供血动脉阻塞后，神经元细胞很快发生不可逆的坏死和凋亡。如今越来越多的研究表明，血管内皮细胞来源的外泌体在减轻缺血事件发生后神经元细胞不可逆性坏死和凋亡方面发挥重要作用[19]。在人脐静脉内皮细胞(HUVECs)和人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)的缺血再灌注损伤体内外细胞模型研究中，HUVECs衍生的外泌体参与调控SH-SY5Y细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭。研究发现，细胞上清及血清中高表达内皮细胞来源的含CD63、HSP70、肿瘤易感基因101蛋白的外泌体，而SH-SY5Y细胞内的凋亡相关分子caspase-3、Bax和Bcl-2表达降低。因此推测HUVECs衍生的外泌体可能通过调控凋亡信号通路中的相关信号分子，抑制SH-SY5Y细胞凋亡，并最终减轻缺血后损伤[20]。研究表明，在急性缺血性脑卒中梗死区域周围，在应激刺激下神经元轴突开始再生，但同时其也被星形胶质细胞形成的瘢痕所抑制[21]。在大脑中动脉栓塞大鼠模型中，通过抑制轴突生长过程中的神经元信号传导和利用氧-葡萄糖缺乏来培养皮层神经元，结果发现星形胶质细胞分泌的外泌体通过增加前列腺素D2合酶表达而促进轴突再生。因此无论外泌体直接减轻缺血后神经元细胞损伤或参与调节神经元细胞轴突的损伤修复、再生，都给损伤后细胞的自我修复机制提供了新的思路和研究方向。

2 外泌体携带的microRNA与缺血性脑卒中的关系

近年来通过外泌体的基因组学分析发现，外泌体参与CIRI的整个发生发展过程中，其内部的microRNA作为潜在的损伤标志物具有重要意义[22]。在一项大样本的病例对照研究中，通过提取72 h内急性脑卒中患者血液中外泌体内的microRNA后测序分析，发现病例组中miR-133表达高于对照组，同时与美国国立卫生研究院卒中量表评分具有高度一致性。miR-133可作为缺血性脑损伤的潜在标志物，在CIRI中具有重要意义[23]。对脑卒中患者血液循环中外泌体内的miR-335和钙调蛋白(CaM)研究发现，miR-335表达下调与血浆中CaM表达升高密切相关，预示着miR-355与CaM之间存在着负反馈调节关系[24]。同时越来越多的证据表明，抑制钙-钙调素依赖性蛋白激酶激酶(CaMKK)信号通路会减轻CIRI，因此通过上调循环中的miR-335表达进而靶向作用CaMKK通路减轻CIRI[25]。在大鼠CIRI模型中发现[26]，外周循环外泌体内的miR-122能够改善大鼠预后，也能够下调靶细胞中MmP8、Timp3、Alox5、Itga2b等基因的表达，同时以上基因参与了白细胞渗出及黏附、花生四烯酸的生成以及动脉粥样硬化的形成，从而参与脑卒中整个发生发展过程。miR-122为脑卒中患者细胞内分子治疗提供了新思路。进一步研究外泌体内microRNA的作用靶点、分子调控机制以及特异性分子标志物，将会为脑血管疾病的诊疗带来新的突破。

3 间充质干细胞(MSC)来源的外泌体在缺血性脑卒中治疗中的作用

MSC在脑卒中治疗中发挥积极作用，同时MSC治疗脑卒中目前已经处于临床实验阶段[27]。研究表明，MSC能够在细胞因子刺激下启动相关信号通路，促进脑卒中后神经细胞及血管再生[28]。亦有研究表明，MSC通过分泌相关外泌体将其功能蛋白、mRNA、microRNA分子转运到远处的受体细胞，通过增强或抑制受体细胞胞内相关分子的表达发挥作用[29]。MSC也可通过促进施万细胞分泌神经血管因子以促进神经生长，同时研究发现MSC也可转化为施万细胞[30]。内皮细胞来源的外泌体能有效增加间充质干细胞的基质金属蛋白酶1(MMP-1)、MMP-3和核因子κB活性而促进MSC的增殖、迁移和分泌[19]。MSC来源的外泌体在肾损伤、肝损伤、心肌缺血再灌注损伤、脑缺血治疗中发挥作用[31]，其机制可能为通过修复血管内皮细胞，从而增强血管的完整性，最终减轻缺血再灌注损伤。同时其他干细胞来源的外泌体参与脑缺血过程的相关研究也越来越多[32]。

众所周知，基因治疗能够从本质上解决肿瘤、脑卒中等疾病，但由于目前在质粒的构建、转染及体内靶向性上存在精准性问题。外泌体被认为是体内基因靶向递送的良好载体，被靶细胞内吞后，其所携带的基因将会在靶细胞内发挥一系列生物学效应[29]。Katakowski等[33]研究表明，MSC源性外泌体含有miR-146b，其被胶质瘤细胞内吞后，抑制了神经胶质瘤细胞的生长，并且较小剂量的外泌体miR-146b就可抑制胶质细胞瘤细胞的生长，改变其表型。与此同时，在另外一项大鼠的脑缺血研究中，通过缺血区域注射MSC来源含miR-133b的外泌体到缺血大鼠脑内，一段时间后大鼠脑内缺血部位神经元可塑性得以明显提高[34]，提示MSC来源的外泌体内的相关分子进入神经元细胞内发挥了潜在作用。进一步研究发现,miR-133b能够作用于靶基因结缔组织生长因子(CTGF)和ras基因家族A，当缺血性损伤发生后，miR-133b使缺血区域的CTGF表达减少，从而减轻了缺血区域的炎症反应[35]，同时又在脑缺血模型的小鼠体内静脉注射MSC来源的外泌体，结果发现缺血区域的突触核蛋白含量和突触的密度明显高于对照组。除此之外，发现缺血区域的微管相关蛋白和血管生长因子含量明显增加。MSC来源的外泌体将会为脑卒中的细胞疗法带来新思路。

多项研究指出，MSC来源的外泌体参与调控受损神经元以及血管内皮细胞的修复，在脑卒中的治疗中发挥重要作用；同时也部分揭示了MSC参与脑卒中治疗的细胞学机制，这将会为临床MSC治疗脑卒中的具体分子调控机制带来新思路。

脑卒中的预防和治疗已经成为全世界关注的问题，合理预防以及有效治疗是提高脑卒中患者预后的重要策略。外泌体及其内部microRNA作为新一代细胞与细胞之间交流的信使，参与脑卒中发生后神经元细胞及血管内皮细胞的损伤及修复。近年来MSC及其分泌的外泌体用于治疗脑卒中也取得重大进展。越来越多的证据显示,外泌体及其内的microRNA参与了CIRI的整个病理生理过程。一个microRNA在体内有很多作用位点，并且多个microRNA可作用同基因位点。外泌体内microRNA作为新型生物标志物在脑缺血再灌注不同的阶段发挥不同作用，同时外泌体及其内microRNA在缺血性脑卒中的诊疗中有优势。与此同时，MSC来源的外泌体在脑缺血动物模型上治疗已经取得突破。未来，外泌体及其microRNA参与受损血管结构和受损神经元修复的具体机制会进一步阐明，外泌体搭载药物靶向治疗脑卒中也将会取得突破，这将为脑卒中患者的治疗和预后带来新的希望。