精子发生障碍导致男性不育的基础研究及其临床应用

李 铮 何祖平 张 锋 夏术阶 姚晨成 袁青青 田汝辉 朱子珏 智二磊 李 朋

精子发生障碍导致严重精子畸形与无精子症，由此引起的不育症与出生缺陷至少影响500万家庭。目前人类对生精障碍发病机制的认识有限，仅认识到Klinefelter综合征、Y染色体微缺失、隐睾、腮腺炎性睾丸炎影响精子发生。由遗传、环境、生活方式导致精子发生障碍的研究，多集中于啮齿类动物，缺乏对人类精原干细胞增殖分化的研究，尤其对调控信号的分子通路所知不多。人类精子发生障碍研究的重点和难点在于：缺乏基于临床家系的致病基因研究，缺少充足组织样本量支持的应用研究，尚无精子无创评估技术和规范化诊疗体系。本项目针对生精障碍，建立多学科研究团队，指导规范化样本收集，深入开展转化应用研究，建立体内体外向精子分化的研究模型。以此为基础，解析精子形成障碍的遗传学因素，建立精原干细胞向精子定向分化新体系，构建拉曼评估精子与生精小管无创平台并将其用于临床，制订精子发生障碍诊疗路径与诊疗新体系。本项目主要创新和研究成果如下。

1 解析精子发生障碍诊疗新靶点

精子形成障碍是精子发生障碍的严重类型之一。精子鞭毛或尾部畸形是导致男性不育的重要原因。精子多发鞭毛畸形表现为精子断尾、缺失、卷尾(MMAF)，目前已知DNAH1突变可以解释其45%的发病原因。本项目组织多学科研究团队，临床收集MMAF家系，建立我国精子发生障碍临床大数据库，探索精子形成障碍导致精子畸形的致病新基因，将多发鞭毛畸形的病因学诊断提高到60%以上。分离生精障碍患者的精原干细胞，揭示3个信号通路与生精障碍密切相关，发现396种微RAN(miRNA)参与表观遗传调控。

2 建立精子发生障碍体外体内分化新体系

对于治疗精子发生障碍或预防出生缺陷，从患者睾丸中获取干细胞，经体外诱导分化获取具有受精功能的精子，一直是人类的梦想。本项目从隐睾患者睾丸中获取干细胞，经视黄酸(RA)与干细胞生长因子(SCF)等条件培养基体外诱导培养，分选获取精子细胞，在国际上首次报道从隐睾患者的精原干细胞诱导定向分化为精子细胞，并证明其有受精潜能。将干细胞诱导分化为有生育能力的精子是治疗无精子症的梦想与挑战。本项目组基于生精障碍睾丸组织库，建立干细胞与支持细胞相互影响研究平台，致力于诱导多能干细胞(iPS细胞)向雄性生殖细胞分化，揭示了一系列影响生精细胞增殖分化的新基因，为精子发生研究和不育症治疗提供了新的方向。

3 建立无创评估生精小管与精子新技术

显微外科取精技术是近年男性不育治疗的里程碑。判断生精小管是否有精子，以提高取精的成功率，主要依靠术者的个人经验，目前尚无好的无创评估方法用于临床。本项目组在国际上首创拉曼光谱无创扫描生精小管与精子技术，对生精障碍患者的生精小管与不育者的精子进行激光扫描，获取精子发生障碍者特征性“分子图谱”。该技术的灵敏度高达90%，而判断生精小管是否有精子的特异度高达86%，减少盲目地破坏生精小管。该项目研究被同行认为是一种无创辨别生精小管的方法，将在生殖医学领域有广泛的应用前景。

4 提出生精障碍诊疗新路径

本项目总结男性不育临床诊疗经验，提出男性不育三分法诊疗体系，建立精索静脉曲张与Y染色体微缺失筛查体系，对射精管梗阻性无精子症进行激光治疗，为男性不育提供诊疗培训教材、诊疗指南与共识。在临床大力推广显微男科与微创男科技术。严重稀少精子的冷冻保存是一个世界性的难题，对于严重少精子症患者极其重要，成功保存该类患者的精子，将使患者生育健康子代，拯救一个幸福家庭。本项目组潜心研究精子冷冻保存的方法和精子冷冻损伤机制，探索出适合精子冷冻保存的方法，指导临床建立超细管冻融稀少精子新体系，为不育症患者提供了更好的生育力保存方法。

5 成 果

基于以上研究，本研究团队先后发表论文20篇，其中在TheAmericanJournalofHumanGenetics、StemCellReports和FertilityandSterility等被SCI收录的期刊上发表18篇。影响因子共77.885，被NautureReviewsUrology、Development、HumanReproductionUpdate等期刊他引149次。获得专利9项，其中发明专利4项，一种分离人精原干细胞的方法、液氮熏蒸冷冻及储运配子一体化装置、一种稀少精子体外培养液3项发明专利具有高度指导意义和应用价值。主编高等教育教材《生殖系统》；主译专著《精子细胞(生成、成熟、受精、再生)》，获得第28届华东地区科技出版社优秀科技图书一等奖；主编《2016中国男科疾病诊疗指南》(精索静脉曲张诊疗专家共识、男性不育相关Y染色体微缺失筛查指南)、《射精管梗阻与精道内镜技术专家共识》，为国内单位开展此类项目提供了规范化诊疗流程。本项目已培养泌尿男科学术带头人2名，青年长江学者1名，东方学者与浦江人才2名，上海领军人才1人，领军候选人才1名，硕士、博士研究生20余名，中青年男性生殖医学骨干5名，亚洲男科学协会与上海市医学会男科专科分会青年委员1名，并向国内其他中心(上海交通大学医学院附属瑞金医院、上海交通大学医学院附属第九人民医院、复旦大学附属妇产科医院、广东省人民医院等)输送男科人才5名，取得了良好的社会效益。连续10年举办中国医师协会男科医师学术年会、上海国际男性健康论坛等国家级继续教育学习班，建立“显微外科治疗男性不育”培训基地，培养全国各省市进修医师500余人次，多次在国际和国内学术会议上作大会发言。

6 完成单位介绍

上海市第一人民医院泌尿外科临床医学中心总体临床服务能力与技术水平居全国综合性医院领先水平，为国家临床重点专科、上海市重中之重学科。中心近年每年门诊诊治国内外男性不育患者超过2万人次，完成男性不育显微外科手术1 000余台，有丰富的临床资源。设立在上海市第一人民医院的上海交通大学泌尿外科研究所，在上海交通大学转化医学平台的框架下，成立了男性健康评估中心；作为上海市生殖医学重点实验室临床基地，有完备的基础研究平台。本项目组申请获得国家重大课题子课题3项、参与3项，承担国家自然科学基金课题4项，上海申康医院发展中心和上海交通大学重点项目各1项。

上海交通大学医学院附属仁济医院设有干细胞临床研究中心与上海市男科学研究所，在男性生殖领域享有盛誉。

复旦大学附属妇产科医院是国内妇产科领域医教研领先医院，近年增设人类精子库项目，对男性不育开展多项生殖遗传研究，受到国内外生殖领域的广泛关注。