生物膜在奶牛乳腺炎致病过程中作用

刘静雨 耿俊俊 邢静茹 刘文娇 张晓建

（河南科技学院动物科技学院，河南新乡 453003）

乳腺炎是奶牛业中最重要的疾病之一，不仅会损害动物健康和福利，并伴有产奶量下降、医疗保健成本增加、淘汰率较高，有时甚至死亡。流行病学研究发现，抗生素治疗后的细菌学治愈率为0～80%，且高达40%的乳腺炎病例似乎是既往治疗失败的疾病，且发病可能性提高了4.8倍。先前研究人员已从血清蛋白结合、脂溶性抗菌剂的pKa值、药效学和药代动力学等方面讨论了抗药性问题，提出了一个假说：在包含葡萄球菌在内的多种微生物受感染组织中，微生物膜的生长，使细菌对几乎所有抗生素产生了抗性。鉴于此，本综述概述了与乳腺炎中细菌生物膜生长相关的机制，以期揭示细菌对几乎所有抗生素的敏感性降低的原因，为奶牛乳腺炎有效防控提供理论依据。

1 生物膜

生物被膜是微生物有组织生长的聚集体。细菌不可逆的附着于惰性或活性实体的表面，繁殖、分化，并分泌一些多糖基质，将菌体群落包裹其中而形成的细菌聚集体膜状物。人们研究认为皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和链球菌的细菌生物膜对抗生素和宿主免疫防御机制的抗性很强，而这些细菌大多也是牛乳腺炎的主要病原体，因此乳腺炎治疗反复感染的困难可能与这些病原体形成生物膜的能力有关。

1.1 生物膜的形成与成熟

在自然环境中，微生物会尝试粘附在可用表面上，并从一个表面扩散到另一个表面，这种表面运动性以及二元分裂导致附着细胞进一步聚集，而这些原代细胞聚集体产生胞外多糖以促进结块。由此可见，生物膜形成的初始阶段包括两个阶段：第一阶段在细胞壁相关粘附素的作用下，细胞与天然聚合物表面的附着增加，粘附于表面。第二阶段是通过细胞增殖形成由细胞外多糖相互连接的多细胞层成熟结构，葡萄球菌会产生糖萼，作为黏液层进一步保护细菌生物膜，但这些粘液层的化学性质仍未完全阐明。任何细菌生物膜的生长潜力均受到生物膜内细胞营养素的可用性和跨生物膜的独特流通通道的限制。另外，pH值、氧气灌注、碳纳米管、来源和渗透压也可影响生物膜成熟。当生物膜达到临界质量时，进入动态平衡，最外层细胞层开始产生浮游生物，这些细菌可以自由逃脱生物膜并在其他表面定殖。

1.2 葡萄球菌产生的生物膜的表型和基因型基础

研究发现，从葡萄球菌会产生的粘液层中纯化出两种多糖级分，多糖I（＞80%）为至少有130个ß-1，6-N-乙酰氨基葡糖残基的线性同聚糖，带正电，多糖II（＜20%）的非N-乙酰化D-氨基葡萄糖残基含量较低，并且含有磷酸盐和酯连接的琥珀酸酯，多糖II为阴离子，结构独特，在细胞簇形成中有一定的功能，被称为多糖细胞间粘附素（PIA），金黄色葡萄球菌也有相同发现。值得注意的是，完整生物膜还有壁绒酸、葡萄球菌表面蛋白、聚集因子、积累相关蛋白和生物膜相关蛋白等其他组分[1]。

研究发现，表皮葡萄球菌0～47突变体存在两种基因型，其中积累缺陷型突变体由于无法形成细胞间聚集，进而无法产生PIA和形成生物膜。另外，icaR基因的缺失增强了PIA表达，也说明该基因位点参与的PIA表达。编码四个基因的ica操纵子存在于大多数金黄色葡萄球菌菌株中，而厌氧可以ica的表达，这也解释了有氧条件下未能观察到PIA产生（以及随后生物膜生长）的原因。表皮葡萄球菌ica操纵子也受sigB操纵子控制，而金黄色葡萄球菌则受辅助基因调节剂（Agr）和葡萄球菌辅助调节剂（sar）的控制。这在一定程度上表明阳性细菌菌株生物膜比阴性菌株生物膜更与重大感染有关。

1.3 大肠杆菌和链球菌产生的生物膜的表型和基因型基础

大肠杆菌的生物膜形成不仅受到生长培养基渗透压增加的抑制，而且其生长强度也与rpoS基因有关，因为rpoS基因是受营养限制和有毒代谢产物的增加而表达的。尽管链球菌生物膜生长已得到广泛研究，但是，就口腔链球菌而言，群体感应和双组分系统在生物膜调节和生物膜的形成机制尚未被阐明。从大肠杆菌中筛选基因文库表明，基因表达的主要改变可能与粘附和迁移有关。在恶臭假单胞菌中，附着后6小时内改变了30多个基因和40多个基因产物，在从浮游生长到铜绿假单胞菌生物膜完全成熟的过渡过程中，改变了800多种蛋白质的表达水平（相当于观察到的蛋白质组的50%），表明该阶段变异的复杂性。

2 生物膜对宿主免疫系统的抵抗力

形成生物膜的外聚合物可保护细菌免受宿主免疫系统的影响。表皮葡萄球菌产生的细胞外粘液既可保护细胞免受巨噬细胞的吞噬，也可免受多形核白细胞中的活性氧的影响。同样，嗜中性白细胞对产生粘液的金黄色葡萄球菌菌株的杀菌活性也会降低。

3 生物膜对抗菌药物的耐药性

与同一菌株的浮游细菌相比，在生物膜中生长的细菌对抗菌剂的抵抗力提高10到1000倍，其具体机制可能包括：（1）抗菌剂通过生物膜基质的渗透延迟；（2）生物膜生物的生长速度改变；（3）由于生物膜生长方式而导致的生理变化，包括“持久”细胞。另外，胞外多糖基质的产生是区别生物膜的特征之一，它会与化合物反应或者吸附进而限制抗菌剂在生物膜内地运输，最终破坏抗生素进入细菌细胞的能力。因此，在成熟的生物膜中可以观察到细菌的缓慢生长，这也说明生物膜中细菌对抗菌剂的敏感性降低。

4 抗生素对生物膜形成的影响

越来越多的证据表明，抗生素不仅对细菌生物膜的有效性不高，而且还可能刺激生物膜的形成。四环素、喹诺司汀-达福普汀和红霉素等三类抗生素使用时，可促进表皮葡萄球菌中ICA基因的表达，进而刺激生物膜的形成，亚抑制浓度的抗生素也会影响重要细菌毒力因子的表达，例如其他粘附分子或毒素。

5 生物膜与乳腺炎

在急性和慢性感染的乳腺组织中，细菌主要粘附在乳腺腺泡和乳腺导管的上皮细胞上，并侵入间质组织中，这些细菌簇往往在暴露病原体后24h出现，同时乳腺内部发生感染，而且，金黄色葡萄球菌乳腺炎分离株中ica基因的表达率最高。另外，抗菌敏感性的转变在一定程度上支持了乳腺感染与生物膜形成有关的假说。在牛原代乳腺上皮细胞测定实验中，非粘附性金黄色葡萄球菌，对新霉素、青霉素、杆菌肽和四环素的敏感性高于粘附葡萄球菌。金黄色葡萄球菌在豆汤或脱脂牛奶中生长形成生物膜的研究表明，抗生素对年轻生物膜（6h）和在牛奶中生长的生物膜的影响大于对较老生物膜（18h）和在肉汤中生长的生物膜的影响，同时也发现庆大霉素和红霉素是对抗金黄色葡萄球菌生物膜最不有效的抗生素[2]。

在乳腺炎的演变过程中，牛乳房的生理变化以及细菌基因表达的变化主要发生在亚临床向临床的过渡期，从而促进了毒力基因的上调以及病原体的“防御性”生物膜生长转变，进入一个细菌的有害生长和分布阶段，最终导致炎症发生和临床体征出现。但是，相变过程中刺激生物膜形成的确切机制有待进一步阐明。

6 结语

随着奶牛场乳腺炎防控力量的加强，乳腺炎的发病率和体细胞数量在一定程度上有所下降，但是乳腺炎仍然是奶牛最重要的疾病之一，研究生物膜的形成和抗药机制仍是未来解决乳腺炎防控的重要基础之一。