肺泡灌洗液Gene Xpert MTB/RIF检测技术在肺结核早期诊断中的临床应用价值*

王敏媛，梁亚萍

陕西省结核病防治院(西安710100)

结核分枝杆菌(M.tuberculosis，MTB)俗称结核杆菌，属于人类重要胞内病原微生物，是结核病的病原菌，可侵犯全身各器官，但以肺部最多见。我国患病人数居全球第三位，且耐药现象严重。造成这一严峻形势的原因：一方面，缺乏敏感度高的诊断方法，延误了患者的诊断和治疗；另一方面，作为金标准的结核菌培养检查方法耗时较长，滞后于临床诊治需要，导致耐药结核病传播的机会增加。因此，如何快速完成对肺结核特别是涂阴和耐药肺结核的确诊对于结核病的防控具有十分重要的意义。Gene Xpert MTB/RIF是WHO最新推荐的肺结核诊断的一线快速检测方法，可同时检测结核分枝杆菌及其利福平耐药，具有全封闭的检测系统、全自动化操作、污染可能性小、人为影响因素少、结果准确度高及检测周期短等优点[1]。但该方法在国内应用较晚，使用率不高。大部分肺结核患者的临床症状不明显，留取的痰标本合格率低，从而影响检出率，而肺泡灌洗液(BALF)由于留取方法不同，可提高阳性检出率，故对结核病的诊断有重要价值。本文即应用Gene Xpert MTB/RIF检测1000例患者的BALF标本，并与浓缩集菌涂片抗酸染色、分枝杆菌液体培养和传统比例法药物敏感性试验(简称“药敏试验”)结果进行比对，评估其检测效能，为该技术进一步应用提供参考。

对象与方法

1 研究对象 根据“结核病诊断和治疗指南”[2]，收集 2018 年 1—12 月在本院就诊的疑似肺结核患者的BALF标本1000例为研究对象，年龄6～78岁，男616例，女384例。其中确诊肺结核患者标本891例为观察组，排除结核病患者标本109例为对照组。每一份BALF标本均行浓缩集菌涂片抗酸染色、分枝杆菌液体培养及比例法药敏试验(培养阳性者)和Gene Xpert MTB/RIF法三种检测方法检测。

2 试剂与仪器 Gene Xpert MTB/RIF 仪器及配套试剂：美国Cepheid公司；BACTEC MGITTM960 液体培养系统、MGIT液体培养管、分枝杆菌联合药敏试剂盒、分枝杆菌培养添加试剂盒：美国BD公司；抗酸染色液：珠海贝索生物技术有限公司。

3 检测方法

3.1 浓缩集菌涂片抗酸染色：按照《结核病实验室标准化操作与网络建设》[3]中的相关要求操作及报告抗酸染色结果。

3.2 培养及药敏试验：参照《结核分枝杆菌药物敏感性实验标准化操作程序及质量保证手册》[4]及产品说明书中的操作要求进行BACTEC MGITTM960液体培养检测。将0.5 ml处理后的BALF标本加入MGIT液体培养管中，置于BACTEC MGITTM960液体培养系统中培养；对培养阳性的标本进一步行药敏试验。BACTEC MGITTM960 系统药敏试验是将从结核病患者标本中分离到的MTB在已知浓度检测药物存在的条件下进行体外培养，观察其生长情况，同时与不加任何药物的对照管进行比较，若菌株在对照管及药物培养管中均生长，则认为该菌株对该药物耐药(R)；若只在对照管中生长，则认为该菌株对该药物敏感(S)。

3.3 Gene Xpert MTB/RIF 核酸扩增检测：按照Gene Xpert MTB/RIF 操作说明书上的步骤，吸取1 ml BALF标本加入前处理管中，然后加入相当于2倍BALF 标本体积的Gene Xpert 样品试剂(SR)，将前处理管旋紧，涡旋振荡15～30 s后，于室温静置15 min，打开反应盒，用无菌吸管吸取2 ml 处理后的样品由加样孔缓慢加入反应盒中，置于检测模块，仪器开始自动化检测；仪器自动过滤和洗涤样品，将超声溶菌释放出的DNA与PCR反应试剂混合，半巢式实时扩增并检测荧光信号，根据循环阈值(Cycle threshold，CT)值的高(CT<16)、中(1628)的判定标准[5]，2 h后仪器给出的检测结果可直接在检测系统窗口下观察。结果判断依照探针的CT值，当内对照探针CT值≤38 即为阳性。5个探针中至少2个探针CT值≤38 即为检测到MTB。该方法检测利福平耐药的基础在于MTB特异性分子信标早期CT值和晚期CT值之差，即ΔCT值，当ΔCT > 3.5时提示对利福平耐药；当ΔCT≤3.5时提示对利福平敏感[6]。

4 统计学方法 使用SPSS 19.0统计学软件对数据进行分析。计数资料以率(%)表示，采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 两组患者Gene Xpert MTB/RIF法检测阳性率比较 BALF Gene Xpert MTB/RIF法检测观察组阳性率为71.2%(634/891)，对照组阳性率为1.8%(2/109)，且两组结果比较差异具有统计学意义(P<0.05)。

2 观察组浓缩集菌涂片抗酸染色、分枝杆菌液体培养及Gene Xpert MTB/RIF法检测阳性率比较 观察组BALF浓缩集菌涂片抗酸染色阳性率为21.2%(189/891)；分枝杆菌液体培养阳性率为36.7%(327/891)；Gene Xpert MTB/RIF法检测阳性率为71.2%(634/891)。三种检测方法的阳性率比较：Gene Xpert MTB/RIF检测法>分枝杆菌液体培养法>浓缩集菌涂片抗酸染色；经两两比较，三者结果差异均具有统计学意义(均P<0.05)。

3 观察组Gene Xpert MTB/RIF法对涂阴及涂阳标本中MTB的检测效能分析

3.1 浓缩集菌涂片抗酸染色镜检阳性时，分枝杆菌液体培养和Gene Xpert MTB/RIF法的阳性率比较：891份BALF标本中，涂阳189例，使用分枝杆菌液体培养法检测阳性169例(89.4%，169/189)；使用Gene Xpert MTB/RIF法检测阳性176例(93.1%，176/189)。两种检测方法结果比较差异无统计学意义(P>0.05)。

3.2 浓缩集菌涂片抗酸染色镜检阴性时，分枝杆菌液体培养和Gene Xpert MTB/RIF法的阳性率比较：891份BALF标本中，涂阴702例，使用分枝杆菌液体培养法检测阳性158例(22.5%，158/702)；使用Gene Xpert MTB/RIF法检测阳性458例(65.2%，458/702)。两种检测方法结果比较差异具有统计学意义(P<0.05)。

4 Gene Xpert MTB/RIF法检测利福平耐药的效能 观察组中327份分枝杆菌液体培养阳性的标本经Gene Xpert MTB/RIF法检测亦为阳性，对这327份阳性标本进行药敏试验，检测利福平是否耐药。药敏试验检测利福平耐药为14例，而Gene Xpert MTB/RIF法检测利福平耐药为17例；在药敏试验中耐药的14例标本经Gene Xpert MTB/RIF法检测亦为耐药。以药敏试验结果为金标准，Gene Xpert MTB/RIF法检测利福平耐药的灵敏度为100.0%(14/14)，特异度为99.0%(310/313)，两种方法检测结果一致性较高。

讨 论

据统计，全世界有1/3的人口感染结核分枝杆菌。WHO报道，每年约有800万新增病例，至少有300万人死于肺结核，所以结核病是严重危害人类健康的全球性公共卫生问题。能够快速检测出各类标本中的MTB、辅助临床医生及早确诊，既是结核病研究领域中需要持续改进的重大课题，也是结核病防治中最重要的环节之一[7]。直接涂片抗酸染色法和分枝杆菌液体培养法是目前结核病实验室诊断的主要方法，他们各具优缺点。直接涂片抗酸染色法具有快速、简便、经济等优点，但缺点是结果受人为影响因素较大，只能判断菌体形态、无法区分细菌死活及菌种类型，并对标本中含菌量要求高，一般标本中结核菌数量≥1×104个/ml时才可检出阳性，故其阳性检出率低；虽然结核菌培养是确诊结核病的金标准，且分枝杆菌液体培养法能提高一定的阳性检出率，可在区分非结核分枝杆菌(NTM)的同时检测结核菌的耐药性，但所需时间较长，恐延误疾病的诊治，从而增加疾病传播的风险[8]。美国Cepheid公司开发的Gene Xpert MTB/RIF检测方法是一种半巢式荧光定量PCR体外诊断技术，它针对rpoB基因81bp利福平耐药核心区间(RRDR)设计引物、探针，检测其是否发生突变[9]，能直接从患者新鲜BALF里同时检测MTB及其是否对利福平耐药(rpoB序列存在突变)，整个检测时间约为2 h，适于临床应用。国内外研究均表明该方法检测的敏感度和特异度都高于目前实验室常规的检测方法[10-12]，在短时间内可同时提供MTB及其利福平耐药性的确诊依据。

从痰标本中检测MTB是目前实验室最常用的方法，但现阶段，我国约有70%涂阴肺结核患者，他们往往临床症状不明显，咳痰少甚至无，故很难留取合格的痰标本，加之目前尚缺乏对痰标本有效的检测方法，使MTB从痰标本中检出的几率降低。支气管镜检查采集的肺泡表面衬液即为BALF，具有污染率低(采集不经过口腔和咽喉)、菌含量高(灌洗部位为病灶所在的肺叶、肺段)的优点，是理想的病原学检查标本，对其进行检测，可增加阳性检出率，进而提高对结核病的诊断效率。

本文中两组患者均行支气管镜检查，留取BALF进行检测。两组BALF Gene Xpert MTB/RIF法检测阳性率比较：观察组为71.2%>对照组为1.8%，且两组结果比较差异具有统计学意义(P<0.05)，提示Gene Xpert MTB/RIF法检测BALF有较高的特异度，与牛波等[13]报道结果一致。观察组891例BALF浓缩集菌涂片抗酸染色、分枝杆菌液体培养及Gene Xpert MTB/RIF法检测阳性率比较结果：Gene Xpert MTB/RIF检测法(71.2%)>分枝杆菌液体培养法(36.7%)>浓缩集菌涂片抗酸染色(21.2%)，提示使用Gene Xpert MTB/RIF法检测BALF的检测效能高于浓缩集菌涂片抗酸染色法及分枝杆菌液体培养法，这与李妍等[14]报道的结果一致。观察组中浓缩集菌涂片抗酸染色镜检阳性(189例)时，分枝杆菌液体培养和Gene Xpert MTB/RIF法的阳性率比较：分枝杆菌液体培养法检测阳性率为89.4%，Gene Xpert MTB/RIF法检测阳性率为93.1%，两种检测方法结果比较差异无统计学意义(P>0.05)；浓缩集菌涂片抗酸染色镜检阴性(702例)时，分枝杆菌液体培养和Gene Xpert MTB/RIF法的阳性率比较：分枝杆菌液体培养法检测阳性率为22.5%，Gene Xpert MTB/RIF法检测阳性率为65.2%，两种检测方法结果比较差异具有统计学意义(P<0.05)，提示在标本含菌量低时，Gene Xpert MTB/RIF法由于检测灵敏度优于分枝杆菌液体培养法，故更适于对临床上涂阴肺结核患者的实验室诊断。有文献报道，Gene Xpert MTB/RIF检测法仅对MTB有特异性，与NTM无交叉反应[15]，提示如果涂片阳性但Gene Xpert MTB/RIF法检测阴性者，不排除NTM感染的可能性。

以药敏试验结果为金标准，Gene Xpert MTB/RIF法检测利福平耐药性的灵敏度为100.0%，特异度为99.0%，两种方法的检测结果一致性较高，与国外文献报道一致[16]。Guenaui等[17]报道大约90%对利福平耐药的菌株会同时对异烟肼耐药，所以检测是否对利福平耐药，在一定程度上可作为耐多药结核病(MDR-TB)的监测指标，很大程度上缩短了MDR-TB的诊断时间，也能控制MDR-TB的传播[18]。

综上所述，Gene Xpert MTB/RIF检测技术是一种以分子生物学为基础的新型结核病检测平台，能够快速、特异地检测肺泡灌洗液中结核分枝杆菌及利福平耐药，尤其适用于临床上涂阴肺结核患者的诊断，对结核病的早期诊断具有重要意义。在结核病高发和耐药形势严峻的地区，开展Gene Xpert MTB/RIF检测对于提高临床医生对疑似结核病患者的诊治能力、快速诊断耐药结核病、指导临床合理用药，具有重要的应用价值。