间充质干细胞来源的外泌体对骨关节炎的治疗作用研究

肖昆林，张蕊，张维杰，马建兵*

(1.陕西中医药大学第二临床医学院，陕西 咸阳 712000；2.西安交通大学附属红会医院关节外科，陕西 西安 710054)

骨关节炎(osteoarthritis，OA)是一种常见的关节退行性病变，以软骨丢失、软骨下骨异常改变、滑膜炎及骨赘形成为特征，常常引起受累关节疼痛、活动受限并最终导致关节功能障碍。随着老龄化社会的到来，OA已经成为中老年人生活质量下降和致残的首要原因[1]。据世界卫生组织预测，我国将成为世界OA患病人数最多的国家[2]。骨关节炎严重威胁人类的健康和生活，给社会带来了巨大的经济负担。传统的OA治疗方法，如功能锻炼、理疗、改变生活方式和使用止痛药物等，都只能暂时缓解症状，而不能治疗OA的发病机制或逆转OA的进程。对于较严重的病例，只能采取关节置换手术治疗，如截骨矫形术、关节镜手术和关节成形术。尽管关节置换手术比较有效，但是患者的不满意度仍高达30%，而且这种方法有一定的使用年限，使用过程中需要复杂的维护，并且这种方法不适合活动量较大的年轻患者[3-4]。因此，寻找一种新的骨关节炎治疗方法一直是该领域的研究热点之一。

1 间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)的特点及直接应用MSCs对OA的治疗

1.1 MSCs的特点及分类 近年来，随着对干细胞研究领域的深入，MSCs用于骨关节炎的治疗引起人们越来越多的重视。MSCs可以自骨髓、脂肪组织、脐带、外周血、滑膜及其他组织中分离得到[5]，是一类具有自我更新能力的多潜能祖细胞，可以分化成多种细胞，包括成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞[6]。由于MSCs较容易获得、对供体的影响小，分化能力强，不仅有助于组织修复，而且还具有免疫调节和抗炎作用，已经被广泛用于各种疾病的治疗，包括对软骨退行性疾病OA的治疗。

1.2 直接应用MSCs对OA的治疗

1.2.1 治疗种类 目前，直接应用MSCs对OA进行治疗包括基于组织工程支架的MSCs植入术和直接将MSCs注入到受损关节的关节腔中。前者主要应用于修复受损比较严重的关节面软骨组织，后者主要应用于早期OA的治疗。两种方法在OA动物模型上都取得了良好的治疗效果。在临床上也有病例报道，影像学显示OA疾病表现得到了改善，问卷调查显示OA患者满意度得到了提高[7]。

1.2.2 治疗优势及存在问题 MSCs细胞由于比较容易获得、增殖能力强，以及在一定的条件下可以定向分化为软骨细胞和软骨组织，在治疗软骨退行性疾病OA方面具有潜在的优势和实际的治疗效果。近年来，许多临床前动物实验和临床试验都证明，间充质干细胞疗法治疗软骨损伤和OA是一种很有前景的新治疗方法。但几乎所有间充质干细胞都有其自身的局限性，如分离采集和运输要求条件高、对供体的年龄要求较高以及体外培养增殖能力有限等，极大地限制了其临床应用。此外，干细胞的数目和修复能力也会随着人体正常的新陈代谢而相应地减低，最终会影响干细胞的活性以及疗效。MSCs等干细胞在体外培养传代的过程中也会不断地衰老，从而丧失其多向分化潜能。因此，对于骨关节炎的治疗，寻找一种易采集、性质稳定、免疫原性低、作用效果好的干细胞替代品以弥补以上的不足成为近几年人们关注的焦点。随着对干细胞研究的深入，人们发现MSCs不仅能通过自身增殖分化替代受损组织，还可以分泌一种重要的微环境调控物质—外泌体，实现对OA疾病的修复治疗作用。

2 外泌体的来源及组成

生物体内除了一些特殊的细胞可以释放一些分泌小泡，例如激素及神经递质外，所有的细胞都可以分泌细胞外囊泡(extracellular vesicles，EV)。这种分泌过程从细菌到植物和人高度保守[8]。EV最初被认为是细胞排除内部代谢废物的一种方式，现在的研究发现EV的作用更多的是在细胞之间进行物质交换，这些交换的物质包括核酸、蛋白质和脂类物质。这些物质在细胞之间进行信号传导，维持细胞正常的内环境稳定或者显示细胞的病理状态。根据来源不同，EV主要分为细胞囊泡和外泌体。细胞囊泡直径大致在50～500 nm之间，来源于细胞膜和融合物向膜外方向分离，释放到细胞外。外泌体直径大致为50～150 nm，由细胞膜包裹内含物向细胞质方向内陷分离，释放到细胞外。

外泌体是具有双层脂膜结构的微型囊泡，来自于细胞内的多泡体(multivesicular body，MVB)，其内含有多种蛋白质、核酸及脂类等物质，核酸包括mRNA及microRNA[9]。外泌体在细胞间信息交流的过程中发挥重要作用，许多细胞类型，包括干细胞、B和T淋巴细胞、肥大细胞、树突状细胞、血小板和肿瘤细胞都可以分泌外泌体，人们在大多数体液如血液、尿液、脑脊液、母乳和唾液中也发现了外泌体[10]。

3 MSCs来源的外泌体及其对OA的治疗

3.1 MSCs来源的外泌体 通过质谱分析和微阵列进行的详细分析显示MSCs外泌体携带有复杂的核酸(mRNA和miRNA)、蛋白质和脂质。MSCs是间质支持细胞，主要用于维持体内组织微环境以获得最佳的组织功能，其外泌体含有丰富的细胞外基质蛋白和酶，可调节和恢复细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)的稳态[9]。越来越多的研究表明，MSCs对疾病的治疗效果主要是通过旁分泌的作用实现的。这主要是基于注入体内的MSCs在体内移植和停留的时间有限，MSCs以旁分泌的方式发挥了其治疗作用，这种作用通过外泌体调节相应组织中的细胞而完成[11-13]。实际上，一些研究已经揭示，在一些疾病动物模型实验中，外泌体作为潜在的治疗手段促进了创伤后组织的再生和修复，包括创伤性脑损伤、肺动脉高压、创伤愈合等[14-16]。对于OA的治疗表明，MSCs外泌体可以介导软骨的修复和再生，改善OA症状及延缓OA疾病的进展。

3.2 MSCs来源的外泌体对软骨缺损的治疗 Zhang等[17]首次证明了人类胚胎MSCs外泌体对软骨组织的修复作用。该研究在12只成年SD大鼠股骨远端的滑车沟制作骨软骨缺损模型，然后在每只动物缺损一侧的关节内注射外泌体，另一侧注射磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution，PBS)作为对照。6周和12周后外泌体处理的缺损组较PBS组在外观和组织学评分方面都有了明显的改善。特别是12周后，外泌体处理的缺损组表现出软骨和软骨下骨的完全修复，其特征包括具有规则表面的透明软骨，完全粘附到邻近软骨，并且ECM沉积非常类似于年龄匹配的未处理对照组。相反，对侧PBS处理的缺损组仅表现为纤维软骨修复。该研究表明了MSCs外泌体作为软骨再生和ECM合成的无细胞疗法的效用。

3.3 MSCs来源的外泌体对OA的治疗 Wang等[18]研究报道胚胎间充质干细胞(embryonic stem cell-mesenchymal stem cell，ESC-MSCs)来源的外泌体可以通过平衡软骨ECM的合成和降解来缓解骨关节炎。研究团队在C57BL/6J小鼠的膝关节进行内侧半月板去稳定化(destabilization of the medial meniscus，DMM)及剪断内侧副韧带手术，建立OA模型。4周后于OA模型小鼠关节内分别注射ESC-MSCs或其外泌体。8周后用组织学染色和国际骨关节炎研究协会(osteoarthritis research society international，OARSI)评分评估软骨破坏和基质降解的程度。结果发现关节腔内注射ESC-MSCs组减轻了模型小鼠软骨破坏和基质降解的程度，而注射外泌体组更大程度提高了Ⅱ型胶原酶(Col Ⅱ)和降低了基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)13的表达。此研究表明ESC-MSCs来源的外泌体通过平衡软骨细胞外基质的合成和降解，对OA产生了良好的治疗作用，从而为OA的治疗药物及给药系统的开发提供了实验依据。

Tao等[19]的研究发现，miR-140-5p过表达的滑膜间充质干细胞(synovium-derived mesenchymal stem cell，SMSC)来源的外泌体(SMSC-140-Exo)可增强软骨组织再生。他们用含或不含miR-140-5p转染SMSC，分离并鉴定由SMSC或SMSC-140s(SMSC-Exos或SMSC-140-Exos)衍生的外泌体。通过切断内侧副韧带和内侧半月板的方法建立SD大鼠OA模型，随机分为四组，术后第5～8周每周1次进行关节腔注射。正常组(未手术组)关节腔内注射生理盐水，接受手术的OA组大鼠分别注射生理盐水、OA+SMSC-Exos及OA+SMSC-140-Exos组大鼠关节腔内注射SMSC-140-Exos。手术12周后收集膝关节标本评估疾病的进展。实验结果显示SMSC-140-Exos在预防OA方面具有良好的效果和巨大的应用潜力。

Cosenza等[20]在Ⅱ型胶原酶诱导的OA(collagenase-induced OA，CIOA)小鼠模型中发现，骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cell，BMSC)、BMSC来源的细胞囊泡及BMSC来源的外泌体均降低了关节软骨的损伤，对软骨起到了保护作用。Zhu等[21]比较了关节腔注射滑膜间充质干细胞来源的外泌体(SMSC-Exos)及诱导型间充质干细胞(induced mesenchymal stem cell，iMSC)来源的外泌体(iMSC-Exos)对C57B/L10小鼠CIOA模型的作用，发现诱导型间充质干细胞来源的外泌体具有更好的治疗效果。越来越多的研究表明，外泌体在介导组织修复中起着主导作用。

最近，Lopez-Verrilli等[22]的研究报道，经血来源的外泌体和骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cell，BMSC)来源的外泌体作用相似，均能促进背根神经节神经元中神经突起的生长，但经血来源的外泌体促进皮质神经元神经突起的生长作用优于BMSC来源的外泌体的作用。但不同组织来源的外泌体对OA的作用是否存在差异，目前尚未见文献报道。目前的研究均显示MSCs来源的外泌体对OA具有良好的治疗作用。MSCs外泌体为开发用于治疗软骨损伤和OA的即用型和无细胞疗法提供了新的视角。

4 MSCs来源的外泌体对OA的治疗机制

关节软骨损伤以后，包括白介素(interleuki，IL)-1β、IL-6和IL-8在内的促炎性细胞因子和MMP-3快速上调，并导致了随后的软骨基质降解和关节损伤[23]。这些促炎细胞因子和MMPs主要由滑膜和巨噬细胞等免疫细胞产生，并促进了OA的发生和发展[24]。MSCs外泌体蛋白质组具有200多个免疫调节蛋白，是多因子协同作用的理想载体[9]。在IL-1β处理的原代软骨细胞中，加入ESC-MSCs外泌体，细胞免疫组织化学结果显示，ColⅡ表达量显著升高而聚蛋白多糖酶(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs，ADAMTS)5表达量显著降低。体内结果同样表明，MSCs外泌体促进了软骨ECM的合成，抑制了其分解代谢[18]。SMSC和iMSC来源的外泌体均促进了软骨细胞的增殖和迁移，而后者具有更强的作用[21]。脂肪组织来源的间充质干细胞外泌体在OA患者成骨细胞中，通过降低炎症和氧化应激反应，增强了成骨细胞的抗衰老作用[25]。

以往的研究表明，microRNA(miRNA)在OA的发生和发展中起到了重要的作用。MSCs外泌体携带有大量的miRNAs，有研究表明这些miRNA参与疾病相关信号转导通路，是MSCs外泌体应对组织损伤和修复的有效调节因子[26]。例如，miR-92a通过靶向调节noggin蛋白经PI3K/AKT/mTOR通路促进软骨细胞增殖和ECM合成，从而缓解OA症状[27-28]。Matsukawa等[29]报道，miR-125b在调节软骨细胞ADAMTS-4的表达中发挥着重要的作用。Meng等[30]研究表明miR-320通过直接作用于靶基因MMP-13来调节软骨的形成。

此外，也有研究报道外泌体内的蛋白成分也发挥了积极作用，已被识别的外泌体蛋白包括：4次跨膜蛋白(CD9、CD63、CD81、CD82)、热休克蛋白(HSP70、HSP90)、脂质相关蛋白和磷脂酶以及与外泌体来源相关的细胞特异性蛋白。这些蛋白在帮助外泌体进出细胞的过程中发挥着重要作用，同时因为这些蛋白的保守性也被用来当作表面标记物来鉴定体外分离得到的外泌体[31]。更多的研究将进一步深入揭示MSCs外泌体在不同的条件下组成成分的变化及其对OA的治疗作用机制。

5 MSCs来源的外泌体对OA治疗的应用前景

MSCs来源的外泌体对OA的治疗在临床上还很少见，还存在一些问题需要解决。在临床研究中，应进一步探索MSCs来源的外泌体在体外培养的最佳条件和体内治疗的确切机制。不过，由于外泌体具有独特的优越性，使其在对疾病治疗中表现了强大的潜在优势。由于外泌体的形成要在细胞内经过多次的包装，因此外泌体具有生理生化稳定性，而MSCs来源的外泌体可做为一种再生药物用于疾病的治疗。外泌体具有特定的结构和大小，有着特定的分子标记，在实验室中通过选择细胞来源和改变培养条件很容易获得特定的外泌体。另外由于外泌体与靶细胞独特的亲和性，使得外泌体成为装载和运输特定蛋白、miRNAs等的理想工具。随着对外泌体研究的不断深入，外泌体对骨科疾病的治疗已经引起了越来越多学者的广泛关注。目前已有许多研究报道MSCs来源的外泌体可以修复受损的组织或细胞，并且MSCs来源的外泌体表现出对OA的治疗作用。在动物模型研究中将进一步探索和验证MSCs来源的外泌体的治疗功效、生物安全性、动力学和生物分布等问题。另外，外泌体的规范化抽提，使用外泌体治疗的规范化用量及疗程等问题，都有待于长期的、大量的实验研究进行进一步探索和验证。这些问题的解决将推动MSCs来源的外泌体应用于临床治疗。如果外泌体可以用特定的生物制剂和某些产品进行包装生产，那么它们将可以大规模应用于临床。未来，MSCs外泌体相关疗法将可能成为临床上治疗OA的常规再生药物。

6 结 论

总之，MSCs外泌体是目前广为接受的治疗疾病的再生药物，足以介导MSCs对疾病的治疗功效。通过选择细胞的来源或通过基因工程操作可以将需要的外泌体进行体外扩大再生产，从而大规模应用于临床。在治疗OA方面，MSCs外泌体可能是比MSCs细胞疗法更安全、更方便和更有效的治疗方式。

目前，外泌体在医学领域的研究才刚刚起步，许多功能及其作用机制尚未完全阐明，尤其外泌体在骨关节炎方面的应用研究还相对较少。随着外泌体在组织修复与再生、疾病诊断、靶向药物治疗、免疫治疗等方面研究的不断深入及研究手段的不断更新，相信MSCs外泌体对骨关节炎的治疗将会取得更满意的效果，得到更广泛的应用。