诱发肺炎动物模型方法及评价

张丹参 张健美

河北科技大学，石家庄，050000，中国

肺炎（pneumocystis carinii pneumonia，PCP）是由流感病毒引起的一种急性呼吸道传染性疾病，是指终末气道、肺泡和肺间质的炎症，可由病原微生物、免疫损伤、理化因素、过敏等因素所致［1］。通常所讲的肺炎主要是指细菌感染引起的肺炎，是最常见一种，典型临床表现主要有寒颤与高热，咳嗽咳痰，呼吸困难，胸痛，严重者可出现神志模糊、烦躁、嗜睡、昏迷等［2］，具有流行广、传染性强的特点，严重威胁人类的健康，因此建立合适的肺炎动物模型对人类临床研究具有重大意义。本文对诱导肺炎动物模型进行了整理，希望为肺炎相关机制的研究及抗肺炎制剂的开发提供一定的参考和依据。

肺炎的实验动物对象多为鼠科类，包括大鼠、小鼠、仓鼠、豚鼠、裸鼠，但也有人用猪、犬、猴和新西兰白兔［1］。研究显示大鼠是建立肺炎模型较为理想的动物，具有死亡率低、阳性率高、易得到较多数量菌体等优点。肺炎是威胁人类健康的重要疾病，随着社会人口的老龄化、免疫受损宿主的增加、病原体的变迁和抗生素耐药性的上升，肺炎的治疗表现为治疗困难、病死率高、预后差等特点。在肺炎的动物模型方面，国内外学者先后建立了多种类型的肺炎模型，这些模型的建立为研究肺炎的发病机制和评价治疗水平奠定了基础［3］。

1 动物的选择

1.1 大鼠

大鼠是建立肺炎动物模型常用的动物之一，经皮肺穿刺法和经皮气管穿刺法适合大鼠肺炎模型的建立，一是操作时直接用胰岛素注射器插入大鼠右肺中叶后注入肺炎链球菌，二是用微量注射器吸取一定量菌液于环状软骨之间插入气管后注射菌液，后直立动物，使得菌液均匀到达两肺，此两种方法用大鼠更容易操作更快速建立动物模型［3］。

1.2 小鼠

小剂量、反复式鼻腔吸入接种更适用于小鼠造模，损伤小，死亡率低，操作简单，目前小鼠是建立衣原体肺炎模型的最佳实验对象［4］。

1.3 新西兰白兔

李斌等［5］采用经皮气管穿刺法和鼻喷雾吸入法反复感染家兔，其结果均成功建立肺炎模型，采用新西兰白兔此种方法具有可操作性、可控性、可适性等优点。

2 诱发肺炎的感染途径及方法

肺炎的接种方式中，不同细菌攻击方式对实验结果有明显差异。文献报道不一，常用的有气管插管法、经鼻腔滴入法、腹腔注射感染法、吸烟感染法、放射性感染法等。国外文献有密闭定流量细菌喷雾箱及气管切开细菌注入等。

2.1 经鼻感染法

经鼻感染法就是将一定浓度的细菌混悬液经一侧鼻腔滴入，动物处于垂直位约1～2 min，使菌液进入肺内，此操作简单［1］。滴鼻法制备肺炎模型操作简单，可以根据实验的病原体选择不同种属、不同状态的实验动物。但其可控性差，菌液可停留在鼻咽部、进入消化道或者因呼气、打喷嚏而丢失，使剂量难以确定，导致模型不稳定。经鼻吸入法多采用密闭定流量细菌喷雾箱，将一定浓度的菌液置超声雾化器中，以一定的雾化速度开启雾化器，雾化器接入塑料容器其中1个入口，从另外一端的出口排出，雾化一定时间，此可大批量同时操作，动物间差异小，相似性、重复性、可靠性、适用性、可控性均较高，操作较简易，伤口感染、出血等并发症的风险小，更符合真实的感染途径，可模拟临床细菌感染性肺炎的整个过程，利于临床研究，实用性强，但设备较复杂，且易造成对环境及实验人员的污染和伤害［1］。

这些实验方法在操作过程中各有优缺点：①气管插管法，操作相对复杂；②经鼻滴入，操作简便，但接种动物通过咽喉反射致部分接种菌液进入消化道，致使剂量难以确定；③气管穿刺能准确把握接种菌液剂量，但难以准确定位穿刺部位，因此有一定难度；④密闭定流量细菌喷雾箱需要较为复杂的设备，而且易造成对环境的污染；⑤直视下气管穿刺法，虽操作简单、剂量易控制、效果肯定，但应注意正规无菌操作，否则以免引起大鼠局部或全身感染，影响实验结果。

2.1.1 小鼠经鼻感染法

清洁级BALB/c 小鼠，8～9周龄，体质量20～25 g，先将动物用乙醚吸入麻醉，然后用加样器吸取相应体积的肺炎支原体菌液或生理盐水缓慢滴入小鼠的鼻腔引发肺炎［6］。研究表明鼻黏膜滴注是模仿自然感染的最佳途径，胡起波等［7］通过滴鼻法成功制备了BALB/c小鼠肺炎支原体（mycoplasma，MP）肺炎模型，并证实小剂量、间隔式的反复滴鼻接种方法更易于造成小鼠MP 感染。孟一鸣等［8］通过实验证明小鼠浅麻醉状态下，破损鼻黏膜，滴注一定量肺炎链球菌菌液。于3 d、7 d、14 d 和21 d 分别处死小鼠，取肺脏进行组织病理学观察，确定肺炎小鼠模型制备的最佳方式。结果鼻黏膜破损组小鼠3 d 时肺泡间隔内毛细血管扩张，肺泡腔内以红细胞和纤维素渗出为主；7 d 时病变以纤维素和中性粒细胞浸润为主；14 d 时肺泡腔内渗出减少，炎症开始减轻；21 d 时肺脏外观趋于正常，肺泡腔内渗出物质基本溶解吸收。

2.1.2 恒河猴经鼻感染致肺炎法

黎东明等［9］用H5N1 病毒感染恒河猴，建立非致死性流感病毒性肺炎模型，以H5N1 病毒液经鼻滴入恒河猴，染毒后第0 h、12 h、1 d、2 d、3 d、4 d、6 d、10 d、12 d 和14 d 采血作血液学和流感特异抗体检测，实验前恒河猴麻醉后将体温芯片植入其颈部后方、肩胛骨上方的背中线位置，用数据收集器扫描芯片来测量猴的体温，观察是否出现流感相关症状和体征，每天2次。感染前按照0.2 mL·kg-1氯胺酮肌肉注射麻醉恒河猴后，经鼻向1～4 号恒河猴滴入H5N1 病毒液2 mL，结果表明经鼻感染后可成功建立非致死性流感病毒性肺炎模型。

2.2 经气管感染法

分为器官穿刺和气管插管，穿刺通常将麻醉动物的颈部切开，暴露气管后，进样针穿刺气管注射菌液；插管操作相对复杂，有内窥镜辅助插管、气管切开下插管、直视下钢丝引导插管、盲插［10］。该法可以直接有效地将细菌接种到肺内，剂量控制准确，但难以准确定位穿刺部位，刺穿法导管完全进入气管，可以使菌液快速到达肺气管，避免了模型动物因菌液堵塞下段气管造成的窒息，虽快速简便，但操作对动物机体伤害比较大。

2.2.1 新西兰白兔经气管感染法

李斌等［5］采用经皮气管穿刺法，用新西兰大白兔成功制备了铜绿假单胞菌肺炎动物模型，将 48只兔随机分为4组，每组12只：经皮气管穿刺组（A组）、经鼻喷雾吸入组（B组）、穿刺对照组（C组）、吸入对照组（D组），于上海市公共卫生临床中心 P2 实验室动物房内分笼饲养。经耳缘静脉注射 2 % 戊巴比妥钠1 mL·kg-1麻醉后，A组用 2 mL 一次性无菌注射器吸取1.5×108CFU·mL-1的菌悬液 1.5 mL 采用经皮气管穿刺法接种，B组用喷雾吸入器使家兔经鼻咽吸入等量菌悬液；C、D组接种感染方式分别与 A、B组相同，以 1.5 mL 无菌生理盐水替代菌悬液。所有兔均隔日施以处理因素，35 d 后停止。实验结果表明使用经皮气管穿刺法和喷雾吸入法接种 PA 至新西兰兔肺部均可成功建立兔 PA 急慢性病程演变的原发肺部感染模型。

2.2.2 大鼠经气管感染法

郭向华等［11］探讨人工绿脓杆菌（pseudomonas aruginosa，PA）生物膜肺部感染大鼠模型肺部细胞因子水平的变化，由支气管内直接注入PA（菌种为PAO579）藻酸盐微粒（1×109CFU·mL-1），建立慢性PA 生物膜肺部感染大鼠模型，以支气管内注入生理盐水作为对照，两周后评估各组动物肺部白细胞介素（interleukin-4，IL-4）、γ-干扰素（interferon-γ，IFN-γ）及肺肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）水平及肺组织病理学的变化，结果成功建立大鼠肺炎动物模型。姚泽忠等人［12］将SD 大鼠用异氟醚麻醉，迅速绑扎在固定台上，用止血钳拉舌固定于口外。接种时在小儿喉镜提供光源情况下，一人用长叶鼻镜暴露声门，并且用带内芯的切合大鼠气管直径（1 mm 左右）的导管缓缓插入气管，待插入适当（0.5 cm 左右）的深度后；另一人缓缓拔出导丝，用注射器把已准备好的0.2 mL 菌液经导管注入模型组大鼠气管，再注入少许空气，使菌液尽可能全部进入气管。立即竖立固定台，使大鼠保持直立位约20 s，并左右摇晃，使菌液均匀分布于两肺，建立肺炎模型。

2.2.3 小鼠经气管感染法

肖舒心等［13］建立耳窥镜直视下气管插管法构建小鼠鲍曼不动杆菌肺炎模型，采用美国Braintree 公司工具盒建立在耳窥镜直视下小鼠气管插管方法。采用1.25% 2，2，2-三溴乙醇（25 mg·kg-1）腹腔注射，待小鼠麻醉后仰卧位固定小鼠于啮齿动物工作台上，采用门齿环一端钩住小鼠门齿，另一端固定于操作台，缓慢倾斜工作台至45°，操作者右手持直头镊牵拉小鼠舌头，左手持带电池手柄的耳窥镜，耳窥镜尖端深入小鼠舌上，透过耳窥镜的放大镜，操作者可观察到小鼠的声门随呼吸而开启、闭合。在小鼠声门开启的瞬间，操作者迅速将已安装气管插管的气管内导管插入气道，并退出导管。将喉镜紧贴气管插管口，喉镜表面有雾气形成表明插管成功。

2.3 腹腔注射感染法

给小鼠腹腔注射细胞病毒建立间质性肺炎模型［14］。构建的模型表现出肺泡壁增厚、水肿，以大量单核细胞为主的炎性细胞浸润，肺泡腔内有蛋白渗出，肺组织细胞坏死，正常细胞器结构消失，该法虽然能构建出肺炎模型，但其与生理情况感染方式大不同，实用性不强。候舒［15］等人取4周龄SPF 级BALB/c 小鼠60只随机分成6组，建立人巨细胞病毒HCMV 小鼠肺炎模型。

2.4 吸烟感染法

将小鼠在密闭玻璃吸烟箱内，每天被动吸烟其吸入量与干湿肺重比、白细胞数目以及炎症因子值呈线性关系。小鼠对于吸烟暴露有较好的耐受性与敏感性，是急性吸烟建模的良好选择。将ICR 小鼠，在密闭玻璃吸烟箱内，每天被动吸烟3次，一次2 支，每次持续20 min，ICR 小鼠急性吸烟3 d为急性炎症的高峰，干湿肺重比、白细胞数目以及炎症因子MPO、TNF-α、MMP-12 的活性均在3 d 达到峰值，之后迁延转入慢性炎症［9］。

2.5 放射性感染法

胸部照射选择全胸照射，照射方法采用直线加速器大剂量单次照射［1］。用浓度为10%的水合氯醛对大鼠麻醉处理之后，让其保持仰卧状态，将大鼠四肢固定在照射台之上，确保胸部处于暴露状态，且用铅板将头部和腹部进行遮挡，调整照射的范围，使照射范围自大鼠双上肢两腋窝中点连线至剑突水平［16-17］。放射性感染法：一般于放疗后的第1 到第3个月开始出现。放射性肺炎的发生、严重程度主要与照射方法、照射剂量、照射面积和照射速度有关［17］。

2.5.1 大白兔放射性感染法

用新西兰大白兔制备放射性肺炎模型，家兔麻醉后仰卧位固定，先CT 扫描定位全肺，勾画出照射靶区，用铅块遮挡靶区以外区域，6 MV-X 射线单次大剂量照射单侧肺，前后对穿射野，总剂量为25 Gy，吸收剂量率2 Gy·min-1，照射距离100 cm。实验组兔的肺在照射1 h 后即出现炎性细胞浸润，12～24 h 肺泡壁开始明显增厚；肺组织观察显示照射2周后，在肺组织表面和切面出现出血点，照射16周后的兔肺组织明显皱缩，色泽苍白，各叶分界不清，中量混浊胸水。实验结果显示，单肺单次MV-X 射线25 Gy 剂量照射能制作可靠、稳定的兔放射性肺炎模型。

2.5.2 小鼠放射感染致肺炎

用6 MV-X 射线对C57BL/6 小鼠进行单次全胸照射建立放射性肺炎模型，照射剂量18 Gy，照射野30 cm×1.8 cm（1.8 cm为小鼠颈部至胸段距离），吸收剂量率200 c Gy.min-1，距离100 cm［16］。

3 诱发肺炎动物模型的病原体及方法

3.1 大肠杆菌致肺炎动物模型

李惠德等［20］建立了大肠杆菌肺炎动物模型，大肠杆菌于营养琼脂斜面存种，4℃冰箱保存，使用前在无菌操作台用内接种环勾取，转种于普通肉汤培养基内，置37℃恒温箱内增菌48 h，用0.9%氯化钠稀释计数，滴定浓度为每毫升3.8×106个，用于感染动物。

新西兰白兔，体重1.7～2.3 kg，背位固定，用细绳牵引门齿，充分暴露颈部，剪去颈周兔毛，用75% 乙醇消毒，将抽取大肠杆菌液的注射器经皮肤插入环状软骨下的气管内，回抽见有大量气泡后注入菌液0.8～1.2 mL·kg-1，然后抬高兔头颈部，使菌液缓慢流入气管下段及肺部。

家兔接种后0.5～1 h 出现喷嚏、喉鸣、拒食、耸毛、蜷缩、颤抖，持续1～3 h，于5～6 h 体温上升，耸毛、蜷缩、颤抖消失，并开始饮水。12 h 体温显著升高，呼吸增快，烦躁不安。部分动物出现紫绀。病理检查肺脏明显充血、水肿，有瘀点、出血点或出血，斑点、斑片弥漫两侧肺叶。病灶区肺泡腔内充满大量中性粒细胞及少许嗜酸性粒细胞。病灶中央或周边可见发炎的细支气管，管壁充血，有少量中性粒细胞、嗜酸性粒细胞浸润。部分粘膜上皮细胞坏死、脱落［21］。

3.2 肺炎克雷伯杆菌致肺炎动物模型

陈业民等［18］将肺炎克雷伯杆菌菌种、增毒、鉴定、培养后稀释成1×107CFU·mL-1的混悬液，用于感染动物。Wistat 大鼠，180～240 g，乙醚麻醉，垂直固定，显露声门，用12 号钝头针头插入气管内，注入细菌混悬液0.1 mL（含细菌量1×106CFU），保持垂直体位5 min。动物在感染后约5～12 h 后出现不活泼、纳差、对外界反应迟钝、背部微弓，继而四肢瘫痪，肺部病变严重者出现呼吸表浅而急促，最后呼吸微弱而死亡。免疫学检查显示细胞免疫功能低下，CD3+、CD4+细胞减少，巨噬细胞吞噬功能明显降低。肺组织病理学检查可分为三度，轻度表现为支气管和细支气管周围及肺泡内有渗出和中性粒细胞、淋巴细胞浸润，间质毛细血管充血。中度表现为多个细支气管及肺泡灶性炎细胞浸润、充血、出血。重度表现为片状炎细胞浸润、充血、出血。部分动物肺门淋巴结反应性增生，个别肺内出现小脓肿。肺水肿表现不明显。

3.3 肺炎支原体致肺炎动物模型

3.3.1 肺炎支原体致小鼠肺炎动物模型

刘晓红等［22］BALB/c 小鼠按体重随机分组，在0、1、2 d 滴鼻感染肺炎支原体菌液，在0～21 d 分批宰杀，并分批设立滴注培养基的对照组，以0～26 分的组织病理学评分来确定肺部的炎症反应程度，所有实验组动物的病原学诊断均作了肺匀浆支原体培养或肺匀浆的支原体PCR 鉴定，于感染1、3、4、6、8、14 d 以 ELISA方法检测了血清干扰素-γ的含量。

3.3.2 肺炎支原体致大鼠肺炎动物模型

李继昌等［23］利用Wistar 大鼠，180～200 g，经1周饲养观察后，挑取健康者40只，雌雄各半，按体重和性别随机分成2组，正常对照组15只，肺炎支原体感染组25只。置于3 级清洁动物室，在标准条件下分笼饲养。将106CFU·mL-1的肺炎支原体培养液缓慢地滴入鼻孔内，利用其自然吸气式动作，将菌液吸入气道至肺部。每日1次，每次0.2 mL。接种后每日观察其活动、进食等情况。

3.3.3 肺炎支原体致金黄地鼠肺炎动物模型

金黄地鼠，体重85～100 g，苯巴比妥钠10 mg 腹腔注射麻醉［24］。取对数生长期肺炎支原体液0.2 mL 鼻腔内滴入。肺组织病理学检查可见，间质水肿、毛细血管扩张、淋巴细胞浸润等间质性肺炎的典型改变。超微病理学检查可发现支原体，在透射电镜下其形态多样化，有球形、椭圆形、长丝状及不规则状，表面为单位膜所包绕，膜内可见3 mm 大小电子密度高的丝状结构，与电子密度高、大小约14 mm 的颗粒相连，它们和核糖体组成支原体的主要成分。

3.4 白色念珠菌致肺炎模型

李军等［25］研究结果，家兔，体重2～2.5 kg，于实验第1～5 d，每天耳缘静脉注射阿糖胞苷440 mg·m-2，6 天后隔日1次维持低免疫状态。第4 日起，给予万古霉素15 mg·kg-1、头孢他定150 mg·kg-1静脉注射，每日1次；庆大霉素5 mg·kg-1静脉注射，隔日1次，预防细菌感染。

采用分区划线法将复活后的白色念珠菌接种于科玛嘉显色培养基上，放入37℃温箱，孵育24 h，平皿上可见密度不等、表面光滑、圆形翠绿色菌落。将分离培养的白念菌接种于50 mL 沙保罗液体培养基中，置于37℃振荡培养箱中振荡培养18 h。以3 000 r·min-1离心5 min，弃上清，反复加入无菌生理盐水10 mL 冲洗2次。将离心后的沉淀物加入生理盐水5 mL 混匀，制成菌液，显微镜下，用计数器计数菌液的浓度。调整原菌液浓度为每毫升5×108个，置于4℃冰箱保存备用。于第6 日采用经皮气管穿刺法接种：将麻醉后的动物固定于手术操作台上，以左手拇指示指固定气管，向气管内注入白色念珠菌菌液0.2 mL（含白色念珠菌1×108个），立即将家兔取头高脚低位，使菌液易进入气管下部。

肺组织病理变化可见，d1 镜下气道内可见真菌孢子。d3 肺组织表面可见大小不一的灰白色病灶，柔软、无硬节；支气管内见少许分泌物，气道周有淋巴、单核细胞浸润，肺组织充血、瘀血，部分肺泡内有蛋白样物及炎细胞渗出，部分肺泡代偿性扩张，肺泡间质有少许陈旧性出血（含铁血黄素）；肺组织内有片状坏死灶，界限较清晰，肺组织呈干酪样坏死，肺泡结构尚存，腔内为坏死物及少量孢子。d5 肺组织表面可见大小不一的圆形、灰黑色病灶，触之呈结节状，质硬；部分支气管内为脱落的上皮细胞，粘膜下见淋巴细胞聚集，部分小支气管内含孢子及菌丝的坏死物，部分气管粘膜及气道壁软组织破坏，小气管周围大量淋巴细胞增生、包绕，巨噬细胞增生，肺组织内有大量灰白结节病灶，镜下病灶界限清晰，中心为干酪样坏死，内含大量孢子、菌丝，肺泡结构消失，周围大量淋巴细胞包绕，周围组织之间多个小灶状病灶，肺泡上皮部分脱落，肺泡腔内见多数巨噬细胞，部分肺泡代偿性扩张，部分肺泡破裂融合成肺大泡。

3.5 呼吸道合胞病毒（RSV）致肺炎模型

田曼等［26］建立呼吸道合胞病毒模型。雌性豚鼠，月龄1个月左右，体重225～300 g，适应环境3 d。①病毒悬液制备：RSV 毒株接种于Hep-2 细胞上，按常规培养，在细胞融合病变最明显时，用力振荡细胞瓶，使细胞从瓶壁脱落，反复冻融3次，4℃离心（800×g，10 min），去除细胞散片。收集病毒悬液，进行病毒滴定，用于动物接种。②动物接种：动物麻醉完全后，鼻腔内缓慢滴入100TCID50病毒悬液0.5 mL，每天1次，连滴3 d。③肺组织标本处理：采用急性失血法处死豚鼠，无菌条件下取出部分肺组织置于灭菌Hank’s 液中，做病毒分离用，其余肺组织做光镜与电镜检查。④肺组织病毒分离：无菌条件下，剪碎新鲜的肺组织标本，研磨后接种到Hep-2 细胞瓶中，观察细胞病变，待细胞融合病变时，收取标本，用免疫荧光法鉴定RSV。⑤免疫荧光法：含有病毒抗原的Hep-2 细胞制成抗原片，冷丙酮固定20 min，取出晾干。每孔加入1 滴RSF/FITC 抗体试剂，37℃温盒孵育30 min，晾干后用基质液封片，移至荧光显微镜下观察。

结果表明，病毒接种后6 d 的肺组织标本，病毒培养后均在第一、二代内出现细胞融合病变，病毒接种后14 d，部分动物肺组织分离出RSV。病毒分离阳性的标本，荧光显微镜下可以观察到细胞胞浆内出现发荧光的结构物，颗粒状或弥散状分布，呈苹果绿色。

光镜下可见，RSV 接种后d 6，豚鼠均患间质性肺炎。小气道、血管周间质及实变区中有大量淋巴细胞浸润；细支气管的微血管内出现大量淋巴细胞、单核细胞、中性及嗜酸性粒细胞，上皮细胞增生肥大或坏死、脱落；肺泡隔增宽，肺泡隔中有淋巴细胞、单核细胞及嗜酸性粒细胞浸润，肺泡上皮肿胀、间质水肿。RSV 接种后d14，以上病理改变基本消失。

电镜下可见，RSV 接种后d 6，肺泡Ⅰ型上皮细胞肿胀，核周胞质中线粒体、粗面内质网减少，线粒体基质变淡，内质网轻度扩张。肺泡Ⅱ型上皮细胞显著增生、融合，板层小体结构松散、空泡化，多数板层小体被排出，堆积于肺泡表面或散落于肺泡腔内。释放于肺泡腔内完整的病毒颗粒，直径约150～200 nm，呈不规则的表面粗糙的球形或丝状体，表面有脂蛋白包膜，包膜内有等螺距盘绕的核衣壳。

3.6 卡氏肺孢子虫致肺炎大鼠模型

3.6.1 卡氏肺孢子虫致大鼠肺炎模型

陈胜霞等［27］建立了卡氏肺孢子虫肺炎大鼠模型，Wistar 大鼠或SD 大鼠，清洁级，雄性，体质量为200～250 g，于腹股沟皮下注射醋酸可的松注射液每只25 mg，每周2次，共8周，同时饮用含四环素1 g·mL-1的冷开水以预防细菌感染，给予通常含蛋白质23%颗粒饲料喂养，饮水量不加限制。诱导8周后，腹腔注射40 mg·kg-1苯巴比妥钠麻醉大鼠，消毒颈部及腹部，剖开腹腔，经腹主动脉采血致死；切开颈部，部分剪开气管，用连有10 mL 注射器的引流管插入气管下端并固定，注入5 mL 生理盐水，反复抽吸收集支气管肺泡灌洗液（broncho-alveolar lavage fluid，BALF）；解剖分离取出整肺，将气管、支气管近端不同肺叶的肺组织切开，作印片3 张；BALF 于2 000 r·min-1离心15 min，留取沉淀物作涂片3 张。BALF 涂片及肺印片作Giemsa 染色，油镜下观察100个视野检查Pc 包囊与滋养体。

颜苹苹等［28］将大鼠经醋酸可的松诱导后，从第3周开始出现消瘦、被毛蓬松、精神萎靡、呼吸急促，开始出现死亡。在肺印片和BALF 涂片中查见含有2～8个囊内小体的Pc 包囊以及成簇出现的滋养体，但肺印片中的虫体数量多于BALF 涂片，故易于检获。死亡鼠前5周以查见包囊为主，5周后（包括第5周）滋养体的数量明显多于包囊，且滋养体、包囊的数量明显多于5周前，死亡鼠以滋养体更为多见。

倪小毅等［29］建立了一种改良卡氏肺孢子虫肺炎动物模型。为了缩短诱发大鼠卡氏肺孢子虫肺炎的时间，减少二重感染，采用地塞米松2.5 mg 皮下注射Wistar大鼠，每周2次，共4周。第2周时，气管内注入冻存的卡氏肺孢子虫，4周后剖杀大鼠。结果表明，在抑制大鼠免疫功能的同时气管内注入冻存的卡氏肺孢子虫，可缩短大鼠发生卡氏肺孢子虫肺炎的时间，并明显减少二重感染。液氮冻存的卡氏肺孢子虫种，可冻存三个月以上，随时解冻取用。李自慧［30］等人综述了卡氏肺抱子虫肺炎动物模型及虫体体外培养研究，一般采用免疫抑制剂诱导的传统方法，同时给予抗生素预防感染。糖皮质类激素是最常用的免疫抑制剂。其给药途径，既可经口（将激素加在动物的饮水中，让其自行饮用），也可经皮下注射。经口给予的药物有醋酸地塞米松、强的松龙等，其诱导成功率较低；而皮下注射的成功率较高，其药物有地塞米松、醋酸可的松和氢化可的松等，诱导剂量每次 25 mg（大鼠），2次/周，共6～12周。无论口服或注射给药，在给予激素的同时，饮水中需加四环素（0.5～1 mg·mL-1）或其他抗生素，以防止细菌感染。

3.6.2 卡氏肺孢子虫致小鼠肺炎模型

陈锡慰等［31］用口服肾上腺皮质激素的方法在国产昆明小鼠体内成功诱导卡氏肺孢子虫感染，体质量10 g左右，雄性小鼠 30只，雌性24只 。免疫抑制剂采用醋酸氢化泼尼松，每支含125 mg·5 mL-1。对实验中途死亡的小鼠予以剖胸取肺制作涂片；对出现消瘦、蓬毛、运动迟缓和呼吸困难的小鼠，则予处死后取肺制备涂片。

3.7 仙台病毒致肺炎模型

仙台病毒鸡胚传代，保存于-30℃，1个月内使用。ICR 小鼠，18～20 g，乙醚麻醉，从鼻腔内滴入仙台病毒液50～100 μL。

第2 天起小鼠出现耸毛、蜷缩、少食、少动、呼吸急促、饮水增加、大便干燥、体重减轻。10 d 左右慢慢恢复。d4～7，肺表面颜色不均，有明显充血和大块凝血，肺重量和肺指数增加，在水中半沉浮，切开有红色液体流出，镜检符合以出血和坏死性变化为主的病毒性肺炎急性早期改变。第2周时肺部充血明显减轻，肺表面仍可见点状瘀血。肺重量和肺指数逐渐降低，切开无红色液体流出，镜检符合病毒性肺炎的中晚期病理改变。d24，肺外观和肺重、肺指数基本恢复正常，镜检仍可见终末细支气管周围有淋巴细胞、浆细胞、吞噬细胞浸润。肺泡间隔增宽，血管扩张，散在的淋巴细胞浸润，肺泡内有吞噬细胞、巨细胞和含铁血黄素沉着，为病毒性肺炎晚期修复性改变［32］。

4 诱发肺炎动物模型的注意事项

注入菌液过程中应缓慢，过快易致菌液咳出。接种剂量和浓度太小，易致接种不成功，接种剂量太大，易致动物过早死亡。因此，应经过反复预实验，确定接种的最适浓度和剂量，成功建立重症肺炎动物模型，更符合生理要求。经鼻滴入时，动物易打喷嚏，经气管感染易使皮肤感染，气管穿刺法难以准确定位穿刺部位，需要娴熟的手术技巧和严格的无菌操作，以免导致模型动物局部或全身感染而死亡。

总之，建立合适的诱导肺炎动物模型对肺炎发病相关机制研究，以及肺炎治疗药物的研发具有重要意义。