神经肌肉接头在增龄相关老年肌少症中的作用探讨

老年肌少症(sarcopenia)是近十年才逐渐被广为人知的一个概念,增龄是导致老年肌少症最重要的原因。肌少症发病机制众多,线粒体数量和功能异常、慢性炎症、肌细胞凋亡、肌肉卫星细胞数量减少、激素水平紊乱、营养不足、运动减少等因素都可以促进肌少症的发生发展。作为连接运动神经元轴突末梢和肌纤维的效应位点,神经肌肉接头(neuromuscular junction, NMJ)在老年肌少症发病过程中具有非常独特且极其重要的作用[1-2]。作为“兴奋-收缩偶联”载体，把神经冲动转化为机械收缩的NMJ到底在老年肌少症过程中发挥了什么样的作用,本文将对此进行综述。

1 NMJ的组成

完整的NMJ由多种细胞类型组成:运动神经元、骨骼肌纤维、神经元末梢部位的Schwann细胞和Kranocyte细胞[3]。运动神经元和骨骼肌纤维是主要组成细胞,末梢Schwann细胞和Kranocyte细胞共表达于运动神经末梢及其所对应的肌纤维,它们表达营养因子、黏附因子和生长相关因子,为NMJ发育和再生过程提供营养支持,并发挥调节作用。

从结构上来看,脊椎动物的NMJ包括3个部分[4]:(1) 突触前膜:即轴突末端,负责神经递质乙酰胆碱(acetylcholine, ACh)的合成、储存和释放。ACh由突触囊泡(synaptic vesicles)所包裹,许多容易释放的囊泡倾向于锚定在突触前膜活性区域(active zones)。(2) 突触后膜:也称为运动终板(end plate),是与轴突末端对应的肌纤维部位。运动终板有规律的内凹,形成许多皱褶,皱褶的存在使终板膜面积扩大了4～5倍,皱褶的嵴部与突触前膜的活性区域相对应,内含有高浓度的乙酰胆碱受体(AChR)、肌肉特异型激酶等因子;皱褶底部含有电压门控钠离子通道。(3) 突触间隙:突触前膜和突触后膜之间宽约50 nm的空间,内部存在乙酰胆碱酯酶(AChE)等大分子复合物,保证神经递质快速释放和降解。

NMJ仅占肌纤维表面积的0.1%左右,但却能将神经冲动从运动神经元传递到肌纤维，形成动作电位并产生肌纤维的机械收缩,实现中枢神经系统对骨骼肌的支配[6]。NMJ传递兴奋的过程主要包括3个方面[5]:(1)突触前膜存在大量的活性区域,使得神经递质可以快速释放;(2)AChR在突触后膜褶皱顶部聚集,并与活性区域对应,提高了AChR活化效率和突触电位生成效率;(3)AChE快速清除ACh,使得传输具有时间保真度。

2 NMJ的发育和成熟

在发育过程中,运动神经元和骨骼肌细胞经过长途迁移、相遇并形成功能性突触[6]。在运动神经元轴突到达肌纤维之前,原始的AChR团簇在肌管的中心,称为预成形。运动神经元轴突到达部分预成形的AChR簇,随后受神经支配的AChR簇不断扩大,而未支配的预成形位点最终消散,最后神经末梢与肌纤维形成1∶1的联系。

出生之前,NMJ在形态和功能上都是不成熟的。出生以后,突触后膜内陷形成许多褶皱,NMJ从扁平的斑块状变成典型的“pretzel”状[7]。AChR属于烟碱样受体,由5个蛋白亚基构成,排列成玫瑰状的管形结构。成熟之前,AChR的亚基构成是α2βδγ,成熟之后γ亚基被ε替代,形成α2βδε结构。同时,突触部位的AChR密度增加10倍,从大约1000 个/μm2到超过10 000 个/μm2,而突触外的AChR密度明显下降,小于10 个/μm2。

NMJ的发育和成熟依赖于神经来源和肌纤维来源的众多分子之间的协同作用,并伴有终末Schwann细胞的参与,最终结果是形成一个高效的递质传递结构,肌纤维由单一的运动神经元轴突支配,突触后膜递质受体与突触前膜活性区域完全一致[3]。或者说,NMJ乃至整个神经系统突触的发育过程就是突触前后膜特化性改变的过程,通过神经递质在神经轴突末端和肌纤维之间进行“电-化学-电”的信号传导,引起肌肉收缩。

3 老年肌少症发生发展过程中NMJ的改变

增龄是导致老年肌少症最主要的原因,增龄过程中NMJ是否会发生改变，以及这些改变对突触功能有什么影响,至今仍然存在争议[8]。然而,AChE染色、光镜和电镜显示,衰老的NMJ形态有显著变化。AChE染色发现NMJ呈现“碎片化”改变,突触后膜区域变大但呈现破碎状态,突触皱褶变性、AChR分散分布，与突触前膜活性区域错位。神经末梢也变得更加曲张,轴突终端异常变薄、膨胀、发芽,其内部的突触囊泡数量减少。电镜观察发现有大片的肌纤维膜,其中有明显的连接褶皱,但没有被神经末梢占据,或神经末梢被Schwann细胞包裹,部分Schwann细胞直接进入突触间隙[9-10]。

衰老后NMJ碎片化改变的可能原因是肌纤维中细胞核位置的中央化改变。肌纤维是多核细胞,成熟纤维的细胞核通常位于肌膜下方。在老化的肌肉中,许多纤维的细胞核不是位于纤维的边缘,而是在纤维的中心区域[11]。

损伤肌肉纤维也会在NMJ中产生类似于衰老的表型变化[12],当肌纤维退化时,可以观察到大部分AChR丢失,神经末梢与肌纤维脱离。然后附近的神经迅速恢复对肌纤维的支配,在之前受损的纤维上出现了一组新的AChR碎片,并可见中央核。

总体而言,NMJ的衰老是一个神经末梢从突触接触中不断退出的过程,导致肌纤维局灶性去神经支配,随后神经再生/发芽，重新支配肌纤维。目前多数学者认为:NMJ在生命过程中的变化,是一种尝试通过向失去运动神经元支配的肌纤维提供新的神经支配、从而补偿衰老过程中运动神经元逐渐丧失的过程[8]。

然而,非常关键、但目前尚不完全清楚的是,这些变化是否反映了NMJ结构和功能障碍是导致老年肌少症的主要原因,还是NMJ受损是继发于与老年肌少症有关的运动神经元和(或)肌纤维功能障碍[3,8]。

4 影响NMJ形成的因子

4.1 对神经冲动传导发挥重要作用的因子

4.1.1 AChR及其亚单位:AChR从“胎儿”向“成人”转变的基础是γ亚单位被ε替代,形成α2βδε五聚体结构[13]。AChR聚集于突触后膜褶皱顶部,是NMJ结构稳定和功能成熟的重要标志。如果AChR从终板膜大量丢失,将会导致NMJ的碎片化改变。皱褶顶部AChR的密度由AChR在突触后膜的插入和移除速率决定,这种插入和移除受到众多其他因子的干预[5]。

4.1.2 ACh:ACh是脊椎动物NMJ的神经递质。ACh最主要的作用就是将运动神经元轴突的神经冲动传导到突触后膜,引起肌纤维的机械收缩。ACh包含于突触囊泡内,一般锚定在突触前膜的活性区域,在神经末梢动作电位作用下,突触囊泡与突触前膜活性区域融合,ACh通过胞吞作用快速释放到突触间隙,与突触后膜上的AChR结合引起肌纤维的机械收缩。完成使命的ACh被AChE快速分解,或者扩散到突触间隙外。

4.1.3 AChE:AChE主要富集在突触间隙,负责水解从运动神经末梢释放出来的ACh,从而终止其对突触后膜的兴奋作用,这是一个非常迅速的过程,可以防止单个AChR通道对神经纤维单个动作电位的重复激活。如果AChE缺乏或者活性受损,会导致AChR的持续激活、AChR通道中钙离子过度流入,导致细胞内蛋白酶如calpain的激活,从而破坏突触后膜。

4.1.4 电压门控钠离子通道(Nav1.5 和 Nav1.4):电压门控钠通道是第二类离子通道,定位于突触褶皱凹槽中。它们降低了将终板电位产生的去极化转化为肌纤维中动作电位的阈值,因此有助于神经肌肉兴奋传导。

4.2 对NMJ形成发挥重要作用的蛋白因子

4.2.1 Argin:虽然Argin在运动神经元、肌肉和Schwann细胞都有表达,但只有运动神经元表达的亚型具有高度的AChR聚集作用。1990年McMahan提出了“Argin假说”[14]:Agrin与肌膜中的受体相互作用,促进AChR的聚集和稳定,从而在NMJ发育过程中触发突触后结构的形成。Agrin基因缺陷小鼠,尽管肌纤维分化不受影响,但神经末梢不能锚定在肌纤维表面,突触后膜无AChR聚集,无法建立起功能性的突触连接,加入外源性的Agrin后仍然可以诱导突触后膜AChR聚集。

Agrin可以将多种蛋白,包括肌肉特异性激酶(muscle specific kinase, MuSK)、AChR、人神经调节蛋白1(Nrg-1)、突触后膜受体缔合蛋白(Rapsyn)、AChE聚集于突触后膜,诱发下游突触特异性基因表达,并促进信号分子逆行输送,进一步促进突触前膜分化。

但是在Argin基因缺陷小鼠早期胎儿膈肌中,可以观察到少量AChR聚集,部分与神经纤维建立了联系[15]。这一现象提示Argin对AChR的调控在突触发育早期不明显,说明Argin未必是诱导突触后膜分化的唯一信号分子。

4.2.2 低密度脂蛋白受体相关蛋白4(low-density lipoprotein receptor-related protein 4, Lrp4):Lrp4的主要作用是与MuSK结合形成受体复合物，然后共同结合Agrin蛋白,并通过Agrin介导MuSK酪氨酸磷酸化。Lrp4只与运动神经元分泌的Agrin结合,Agrin又可以促进Lrp4与MuSK的结合[16-17]。体外培养Lrp4缺陷的小鼠肌管,即使添加Agrin也不能形成AChR聚集簇,说明Lrp4是Agrin/Lrp4/MuSK复合物中不可或缺的一环。

在NMJ中,Lrp4同时表达于骨骼肌纤维和运动神经元。在骨骼肌和运动神经元中选择性缺失Lrp4,可以观察到NMJ的形成完全消失，但如果仅在运动神经元或者骨骼肌中选择性缺失Lrp4不会导致任何缺陷表型[18]。

4.2.3 MuSK:MuSK是Lrp4-MuSK受体复合物中的重要信号元件,与Agrin结合后触发了突触后结构的分化,MuSK对胚胎肌管AChR的聚集、成熟突触后膜AChR的锚定和聚集都发挥了重要作用。MuSK缺陷小鼠培养的肌管不会积累任何自发的AChR聚集簇,也不会对外源性的Agrin产生反应。

MuSK在早期肌小体就开始表达,贯穿于整个肌肉发育过程[19]。激活的MuSK除了促进肌管AChR的聚集,当它在受神经支配的骨骼肌非突触区表达时,可导致无神经突触后结构的形成。此外,MuSK在一定程度上可以诱导作用于突触前运动轴突的逆行分化信号[19]。

4.2.4 Downstream of tyrosine kinases-7 (Dok-7):与Lrp4是MuSK的共同受体类似,Dok-7是MuSK活化所必需的适配体,或者说是MuSK的接头分子[20]。但与Lrp4不同的是,Dok-7仅表达于骨骼肌和心肌。Dok-7基因敲除小鼠中培养的肌管在添加Agrin后不会形成AChR簇,MuSK也不会被激活,这表明Dok-7对MuSK的功能是必需的。Dok-7一个不寻常的方面是,过表达Dok-7足以在培养的肌管中形成AChR聚集簇,并使小鼠在没有MuSK的情况下存活数周[20-21]。

4.2.5 Rapsyn:Rapsyn是一种细胞质支架蛋白,在NMJ早期发育阶段就已经存在,在成年肌纤维中,主要表达于突触部位。在MuSK作用下,Rapsyn与AChR紧密结合,形成两种蛋白复合物的高密度网络[22]。Rapsyn对AChR与突触后结构的连接起着至关重要的作用,但对突触相关基因的转录没有明显作用。因此，Rapsn基因敲除小鼠的表型没有MuSK、Lrp4或Dok-7缺陷小鼠那么严重,出生后它们能够微弱地呼吸,存活数个小时。

4.3 对NMJ形成发挥辅助作用的蛋白因子

4.3.1 Wnts:Wnts是一大类分泌型糖蛋白,存在多种亚型,它的最大意义在于提供了一种非Agrin依赖的信号通路，介导早期NMJ的特化过程。Wnt蛋白通过其信号通路中的关键脚手架分子Dvl因子与MuSK的胞内域结合,从而激活MuSK,并促进AChR在肌肉中心区域的预排[23]。Wnt-3、Wnt-4、Wnt-9a和Wnt-11都具有这种作用,而另外一些Wnts则抑制Agrin介导的AChR 聚集簇形成。

Wnts在NMJ形成过程中发挥了重要作用,部分作用是通过MuSK实现的。但是,所涉及的具体机制仍然不清楚,这与存在过多Wnt亚型、相互之间形成干扰有关。

4.3.2 其他因子:肌营养不良蛋白-糖蛋白复合物(dystrophin-glycoprotein complex, DGC)、神经调节蛋白(neuregulins, Nrg)及其酪氨酸激酶(ErbB)受体都在突触后膜特化过程中发挥相应的作用,它们的缺失会影响AChR稳定性、AChR密度和褶皱形成。

另外,某些营养因子如脑源性神经营养因子(BDNF)、胶质源性神经营养因子(GDNF);胰岛素样生长因子(IGF-1)及一系列细胞外基质蛋白如层连蛋白laminin、胶原蛋白collagen Ⅳ和ⅩⅢ;部分miRNA如miR-206、miR-218都可能参与了老年肌少症过程中NMJ的退变。

突触后膜上AChR的半衰期约为13 d,蛋白激酶A(PKA)和蛋白激酶C(PKC)在AChR的循环利用中发挥了多方面的作用。我们在既往研究中也发现,在老年Ⅱ型肌纤维NMJ部位,PKA RIIa异常聚集,并且和cTnT相结合,直接介导了cTnT促进Ⅱ型肌纤维NMJ增龄过程中的退变[24]。

5 影响NMJ老化退变的信号机制

5.1 Agrin-LRP4-MuSK信号通路 这是调节突触后膜AChR定位并聚集成簇的经典通路,也是老年肌少症NMJ受损最被关注的通路。如前所述,Agrin与LRP4、MuSK结合形成复合物,并激活MuSK,活化的MuSK招募AChR偶联蛋白Rapsyn,促进AChR在突触后膜定位和聚集,从而调节NMJ的形成。衰老可以引起Agrin的异常剪切[25],异常的Agrin无法激活MuSK,从而扰乱了AChR的定位和聚集,导致NMJ退变。LRP4和MuSK基因在衰老过程中出现异常表达[26],这也导致NMJ形成障碍。

Agrin-LRP4-MuSK信号通路基本上可以解释NMJ突触前、突触后装置的精确匹配。但这条通路也不是调控AChR聚集的唯一信号通路,另外NMJ的发育和维持稳定并不是从神经到肌肉的单向调控,还存在从肌肉到神经的逆向信号传导。比如,Lrp4会逆行地从肌肉向神经传递信号,以保持神经-肌肉的完整连接[27]。

5.2 Wnt信号通路 已有研究表明,LRP4和MuSK突变小鼠的NMJ发育缺陷表型要比Agrin突变小鼠严重得多,尤其在胚胎发育早期,LRP4和MuSK突变小鼠骨骼肌表面AChR 聚集簇“预排”完全消失,而Agrin突变小鼠依旧能够形成AChR聚集簇“预排”,提示体内存在一种非Agrin依赖的信号通路介导早期NMJ的发育。Wnt信号通路就发挥这样的作用。

Agrin缺乏时,MuSK通过与Wnt蛋白结合而被激活,在通路关键脚手架分子Dvl和下游信号分子β-Catenin作用下,发挥调节AChR聚集的作用。衰老过程中，Wnt信号通路表达下调,降低了非Agrin依赖途径MuSK的激活可能性,干扰了AChR聚集簇“预排”的形成。但不同类型Wnt分子可能在NMJ发育过程中发挥不同的作用。体外实验结果显示,Wnt3a、7a、8a和10b能够抑制Agrin介导的AChR聚集簇形成,而Wnt9a、9b、10和16则以Agrin非依赖方式诱导AChR聚集簇形成[23]。

5.3 线粒体功能障碍和PGC-1α信号通路 线粒体功能障碍是老年肌少症发病过程中的重要方面[28],增龄相关的PGC-1α信号通路下调会导致NMJ不稳定、肌纤维神经支配改变[29]。

5.4 其他可能的信号通路和机制 NMJ重构过程中受到自噬的影响,尽管迄今尚未发现自噬相关基因与老年肌少症直接相关,但自噬的良好平衡对于保持骨骼肌的完整是至关重要的。第二信使在营养不良肌肉中对保持NMJ连续性具有关键作用[30],但是否和老年肌少症NMJ的改变有关尚不明确。

6 小结

NMJ是神经肌肉系统中信号传导的关键环节,也是老年肌少症发病机制中的关键方面。迄今为止，已经发现了众多和突触前膜、突触后膜生长发育相关的因子,也发现了一些有意义的信号通路,它们都对NMJ的形成和稳定发挥各自的作用,为老年肌少症的临床干预提供了可能的靶点。随着连续活体成像结合特殊染色、示踪标记、转录组学、基因编辑等技术的发展,我们将更加清晰地了解老年肌少症发生过程中NMJ的形态学变化和功能改变,更加深入的明确这种退化内在的分子机制,从而为老年肌少症的诊治提供新的理论依据和有效干预途径。