X射线测定蛋白质结构的技术进展与研究现状

熊 强，丁立新，姜晓燕，丁库克*

（中国疾病预防控制中心辐射防护与核安全医学中心放射生态研究室，北京 100088）

蛋白质是生命活动的主要执行者之一，正确且完整的结构是保证其正常功能发挥的前提，因此蛋白质结构的研究是目前最热门的研究领域之一。对蛋白质三维结构的研究，一方面对于深入了解生物体内的生命过程有重要意义，另一方面对于重大疾病的预防和治疗、新型高效药物和疫苗的研发等有重要的作用。目前测定蛋白质三维结构的实验方法主要有X射线晶体衍射技术（X-ray crystalline diffraction）、多维核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）和低温冷冻电镜等[1]（表 1）。NMR 对于相对分子质量很大的生物大分子的分辨能力有限，导致其结构无法解析，同时制备同位素置换样品是一件昂贵且费时的工作；低温冷冻电镜方法近年来在解析膜蛋白和大型蛋白质复合物结构方面受到很多研究者的青睐，但是由于获得足够大小的晶体比较困难，电子与蛋白质相互作用，发生多重散射使得其内部结构分辨率较低等，目前最常用和最准确的测定蛋白质三维结构的手段仍是X射线晶体衍射技术[2]。截至2017年12月31日，蛋白质结构数据库（protein data bank，PDB）中储存了126 690条蛋白质结构数据，其中114 421条是通过X射线测得的，约占90%。

表1 3种测定蛋白质结构方法的比较

1 X射线测定蛋白质结构的原理

在解析蛋白质三维结构中应用的是波长在1Å左右的X射线，由于该波长与蛋白质晶体内原子间距离的数量级相同，且晶体结构内分子规律性排列，当X射线入射到晶体上时，晶体中的每一个原子都发射出次生的X射线相互干涉迭加，并产生强X射线衍射[3]。这个过程与光学显微镜成像有相似之处：显微镜物镜汇聚从被观测物体表面反射的散射光而成像。对于X射线来说，虽然没有一种材料可以直接作为物镜汇聚散射光形成物像，但是晶体的衍射现象与晶体内部的结构有一定的关系，即衍射方向与晶体内晶胞的形状、大小有关，而衍射的强度与重金属原子在晶胞中的排列方式、周期等特点有关[4]。

与人的指纹相似，晶体衍射图谱衍射线的分布位置和强度有着特征性规律。通过分析晶体内衍射点的排列方式和点间距离的大小来推算分子在晶体结构中的排列方式和重复周期的长短；通过测量衍射强度，借助电子计算机，结合一系列数学方法，可算出分子内每个原子在空间的坐标，从而测定整个分子的晶体结构[5]。

2 X射线应用于蛋白质结构测定的发展

自Rontgen发现X射线以后，越来越多的物理学家开始探索其性质和应用。1934年，Bemal和Crowfoot获得了第1张蛋白质晶体的X衍射照片，但是当时理论比较局限，无法解决蛋白质大分子晶体衍射的相位问题。直到1953年英国的晶体学家Perutz和他的同事提出将重金属原子引入蛋白质晶体中，通过多对同晶置换法（multiple isomorphous replacement，MIR）解决相位问题，才从理论上实现测定蛋白质大分子晶体结构的可能性。后来Kendrew和Perutz分别利用这种方法得到了鲸肌红蛋白和马血红蛋白的低分辨率晶体结构[6-7]，自此X射线晶体衍射技术在蛋白质结构测定中得到了实际应用。事实上，第1个用X射线晶体衍射技术测定蛋白质晶体结构并解释分子机制的是溶菌酶，Blake和Phillips分别在1965和1966年测出其三维结构并详细阐明了其作用机制[8-9]。

3 同步辐射

1961年，美国国家标准局在同步加速器真空盒切线方向上附加了一个真空装置，建造了第1个用于紫外辐射的同步辐射装置，该装置的成功建设引起了在世界范围内将同步辐射作为X射线光源的兴趣。1981年美国的第2代同步辐射装置（NSLSII）建成了世界上第1条用于测定蛋白质等生物大分子晶体结构线站，此后世界各地的同步辐射装置纷纷建立了蛋白质晶体学线站。同步辐射因为拥有极高的强度、很好的准直性和方便可调的入射X射线等优点，在蛋白质晶体解析方面有巨大的应用潜能。

3.1 相位问题

解决相位问题是蛋白质晶体分析过程中最重要的步骤之一，同时也是最困难的地方。由于同步辐射能够灵活改变X射线波长，为解决相位问题提供了一种有力的工具——反常散射。Venkatraman Ramakrishnan，Thomas A.Steitz和Ada E.Yonath 3位科学家因在核糖体结构和功能方面作出杰出贡献而被授予2009年诺贝尔化学奖，在公告材料中指出，由于同步辐射可调波长的特性，可以利用反常散射来确定相位。Doutch等[10]在研究三聚类裂环无色杆菌亚硝酸还原酶（achromobacter cycloclastes nitrite reductase，AcNiR）时，利用蛋白质固有元素硫的单波长反常衍射（single-wavelength anomalous diffraction，SAD）来解决相位问题，发现用较短的波长就可以得到比较理想的结构。Harada等[11]研究含血红素铁的虹螺杆菌的原生细胞色素C时，利用晶体中铁的多波长反常衍射（multiwavelength anomalous diffraction，MAD）来确定相位。SAD和MAD是目前最常用的解决相位问题的方法，但是由于晶体内部结构紊乱、辐射损伤和其他能引起反常衍射的原子等原因，单个晶体的反常衍射常常有一定的误差。2011年Liu等[12]利用多个晶体的反常衍射数据解决相位问题，在结构建立、电子密度图和精化等方面都有所提高。

3.2 小角X射线散射

20世纪70年代之前，小角X射线散射（small angle X-ray scattering，SAXS）由于光源的原因发展非常缓慢。直到80年代以后，同步辐射作为SAXS的光源，提供了极高的入射光强度，有效减小了光斑，实现对样品的快速曝光，使得SAXS在蛋白质溶液结构和动态变化中得到广泛的应用。Li等[13]利用SAXS研究玉米醇溶蛋白（zein）时，观察到了该蛋白在不同溶剂中的尺寸形状和分散状态，从而得到了蛋白质在溶液中的构象等信息。蛋白质复合物结构十分复杂，用SAXS解析蛋白质复合物结构时需要联合其他手段。Zhang等[14]研究细菌的四型酰胺酶效应因子（type VI amidase effector，Tae4）和免疫因子（type VI amidase immunity，Tai4）形成的复合物时，利用SAXS和分析超速离心，观察到该复合物是一个四聚体，同时还发现了这4个单体之间相互结合的机制。Sonderby等[15]研究了38对蛋白质复合结构，通过联合SAXS和网络对接模拟数据，更加便利地得到蛋白质复合体在溶液中的构象和三维结构。近几年，SAXS的飞速发展也使得一大批针对SAXS的实验设备随之产话生[16]。

3.3 串行晶体学

串行飞秒晶体学（serial femtosecond crystallography，SFX）是在X射线自由电子激光（X-ray free-electron laser，XFEL）出现后发展起来的一种新型解析蛋白质结构的方法。但是由于目前世界上仅有5台XFEL装置能开展SFX，而现在最先进的第三代同步辐射光源已经超过了20台，所以基于同步辐射的串行晶体学（serial synchrotron crystallography，SSX）逐渐被重视，且发展迅速。SSX用于蛋白质结构解析上具有可在室温下收集衍射数据、能解析微小晶体结构等优点。Stellato和Botha的团队在室温下用SSX分别照射油脂相中的膜蛋白和毛细管中流动的晶体获得了衍射数据[17-18]。Coquelle等[19]通过扫描固定域薄硅片上随机取向的晶体，获得母鸡卵白溶解酵素（hen egg-white lysozyme，HEWL）微小晶体高分辨率结构信息。在SSX的各种研究方法中，最常用的是将晶体固定在微流体芯片等基片上，从而收集基片上每个晶体的衍射数据，这对蛋白质微小晶体的解析有重要意义[20]。

4 X射线自由电子激光

2009年，美国SLAC国家实验室建成了世界上第1台X射线自由电子激光装置LCLS。XFEL是一种新型的、完全相干的X射线，其工作原理和同步辐射完全不一样，它的出现，为解析物质结构提供了一种全新的方法。因为XFEL拥有高强度、超短时间脉冲，可用于解析微小晶体或者无法结晶蛋白质的结构，同时也可以在晶体受到辐射损伤之前获得衍射图案。

4.1 微小晶体

传统的X射线晶体衍射技术需要增大入射强度来记录微小晶体的衍射数据，这样对晶体的损害较大。现在通过将悬浮有大量微小晶体的溶液约束成射流，不断传送到光照区，SFX同步监控收集衍射数据[21]。Chapman和他的同事用硬XFEL的飞秒脉冲收集了300万张衍射图案，使用脉冲频率比绝大多数辐射损害的时间尺度要短，减轻了辐射损伤的问题[22]。牛细胞色素c氧化酶（cytochrome c oxidase，CcO）是一个高辐射敏感的蛋白，Hirata等[23]通过对比XFEL和同步辐射对CcO中过氧化物配体的辐射损伤，发现XFEL对CcO基本无损伤。

4.2 膜蛋白

膜蛋白由于其疏水特性，与生物膜结合成稳定的自然构象，难以形成足够大和高纯度的晶体。在XFEL基础上发展起来的SFX使得膜蛋白的结构解析成为可能，其中最热门和最早解析的是G蛋白偶联受体（G-protein-coupled receptors，GPCRs）[24]。SFX解析膜蛋白结构时，一般是通过收集膜蛋白在脂立方相（lipidic cubic phase，LCP）中晶体的衍射数据来解析膜蛋白结构，例如K+通道[25]、Na+/Ca2+泵[26]等膜蛋白结构的解析。然而，受限于XFEL的发展，SFX并不是作为膜蛋白结构解析的常规方法。

4.3 时间分辨测量方法

在生物学分子结构和功能关系的研究中只有提及功能，结构的变化才显得有意义。随着XFEL的发展，延伸出来了通过时间维度和时间分辨收集数据的方法来解析蛋白质结构，了解大分子的快速动力学。该方法是通过一种叫“泵－探针”的实验来实现的，在这个实验中，光敏感分子通过一束激光（泵）触发时间依赖的变化，在一定的时间间隔内，结构变化通过X射线脉冲（探针）来检测。这项技术被用在观察一氧化碳的光解作用来探索肌红蛋白（myoglobin）和血红蛋白（hemoglobin）结构变化[27-28]。Schotte等[29]在观察光敏感黄蛋白（photoactive yellow protein，PYP）顺式－反式的光异构化的转变时，观察到了一个顺式中间体。这个中间体存在的时间极其短暂，只有600 ps，而这个实验最短能观察到100 ps的变化。不仅如此，XFEL也可以实现fs级别的检测范围。一个研究一氧化碳肌红蛋白的实验观察到了ps级别的螺旋运动，这也揭示XFEL在探测超快运动现象中的潜能[30]。

5 总结与展望

如上所述，在过去的几十年中，高分辨率结构分析的X射线工具已大量涌现，让我们可以在原子水平上解决生物分子相互作用及其机制。同步辐射和XFEL从某种程度上说是互补的两种光源。目前同步辐射主要解析的是静态或微动态的蛋白质结构，XFEL则可以提供ps量级甚至fs量级的动态结构。而且二者都拥有相对高能量、短脉冲的特点，能够解析微小晶体和膜蛋白结构，甚至能实现“不需要晶体的结构解析”。不难看出，今后X射线光源会朝着更高强度更短脉冲的方向发展，我们相信随着第三代同步辐射、XFEL的发展，甚至新光源的出现，目前存在的难题会迎刃而解，对蛋白质结构的解析也会上升至一个新的高度。