益气固表丸对慢性阻塞性肺病模型大鼠JAK/STAT通路影响研究＊

金 晶，王 晶，姚梓平，李风森＊＊

（1.新疆医科大学中医学院 乌鲁木齐 830011；2.新疆医科大学第一附属医院 乌鲁木齐 830054；3.新疆维吾尔自治区呼吸病研究重点实验室 乌鲁木齐 830000）

慢性阻塞性肺疾病（Chronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD）是一种反复发作的气道慢性炎症性疾病。酪氨酸蛋白激酶/信号传导因子和转录激活因子（Janus Kinase/Signal Transducer and Activator of Transcription，JAK/STAT）信号通路已被证实广泛参与于COPD病理过程中细胞炎症及免疫应答[1]。近年来中药复方通过多环节、多靶点协同干预的优势，能够有效改善COPD患者的临床症状[2]。益气固表丸（制剂号：ZJ20130098，国家发明专利号：201410536529.5）由党参、炒白术、茯苓、陈皮、法半夏、生薏苡仁、浮小麦、紫苏子、蜜款冬花、黄芩、伊贝母、蜜枇杷叶、防风共13味中药组成[3]，是新疆维吾尔自治区某三甲医院治疗COPD等肺系病症的常用复方制剂，自2004年以丸剂形式投入临床以来能够有效改善患者咳嗽痰多，汗出易感等症状[4,5]。本研究通过分析益气固表丸对COPD模型大鼠治疗前后JAK/STAT信号通路相关炎性因子表达的影响，探讨其治疗COPD有效性的可能机制，为中西医结合治疗COPD探寻新途径。

1 材料和方法

1.1 实验动物

新疆医科大学实验动物中心提供[动物生产许可证号：SCXK（新）2011-0004，实验单位使用许可证号SCXK（新）2011-0001]的SPF级鼠龄8周的雄性Wistar大鼠60只。饲养环境模拟自然昼夜条件，温度（21±2）℃，湿度40%-50%，自由饮水，正常饮食，体质量约（200 ± 50）g。

1.2 试验用药

益气固表丸购自新疆医科大学附属中医院中心药房（新疆制药厂，批号20121212），脂多糖（LPS，美国Sigma公司，批号：L-2880），雪莲过滤嘴香烟（新疆卷烟厂，烤烟型，焦油量13 mg烟气烟碱量1.1 mg烟气一氧化碳量13 mg），大鼠IL-17a、IL-23、IFN-γ及RORγt ELISA试剂盒（武汉基因美生物科技有限公司，批号均为：GR201604-1），Platinum SYBR Green qPCR Super-Mix-UDG试剂盒（美国Invitrogen公司，批号：C11733-038），Trizol试剂（美国Invitrogen公司，批号：15596-026），M-MLV First-Strand Synthesis Kit反转录试剂盒（美国Invitrogen公司，批号：C28025-032），RT-PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 试验仪器

试验动物烟熏箱（自制，大小60cm×50cm×40cm），Wistar大鼠全身暴露型无创肺功能检测仪（型号：PLY3211，美国Buxco Electronics公司），电子高清显微镜（型号：U-CMAD3，日本Olympus公司），全自动图像分析仪（型号：U-CMAD3，日本Olympus公司），Thermal cycler深孔PCR仪（型号：C1000，美国BIO-RAD公司），全波长酶标仪（型号：Multiskan Spectrum，德国Thermo公司）。

1.4 COPD动物模型造模

模型组及益气固表丸组大鼠（n=40）放置于动物烟熏箱内，给予被动熏烟，烟雾浓度450-500 bpm，30 min/次，间隔3 h/次，12 h更换烟盒1次，同时气管内滴注LPS 0.2 mg·kg-1，共计84天。并于大鼠造模第一天和最后一天，检测大鼠体质量，采用Wistar大鼠肺功能仪检测大鼠肺功能指标：吸气峰流速（PIF）、呼气峰流量（PEF）和每分钟通气量（MV），与空白组大鼠比较，下降幅度大于30%即为造模成功[6]。

1.5 试验方案

大鼠按照随机数字原则分为3组，分别为：空白组（n=20）、模型组（n=20）、益气固表丸组（n=20）。按照人与动物间体表面积折算等效剂量公式折算出试验用大鼠的每日灌药量（513 mg·kg-1），空白组及模型组大鼠每日予0.9%生理盐水6.6 mL灌胃，益气固表丸组给予益气固表丸水溶液6.6 mL灌胃，每日两次，所有的大鼠在给药期间喂食正常饮食，灌胃84天，处死各组大鼠，取外周血及肺组织进行分析。

表1 JAK1、JAK3、STAT1及STAT3引物序列表

1.6 病理标本的制作

垂直于支气管的肺矢状面最大周径处取材，取厚约5 mm的取各组大鼠左肺组织，剪成面积为1.5 cm2左右的小块，浸入2 mL 4%多聚甲醛溶液中固定，使用PBS缓冲液洗涤，并浸泡于固定剂中至少24 h以上。甲醛固定后，石蜡包埋，将标本切为3-4µm并加工用于HE染色。

1.7 外周血IL-17a、IL-23、IFN-γ及RORγt水平的ELISA检测

取各组大鼠外周血2 mL，离心3 000 rpm，10 mins，取血清保存于EP管置于-80℃冰箱保存，检测时根据试剂盒说明书操作，于设置450 nm波长的酶标仪上机检测并计算IL-17a、IL-23、IFN-γ及RORγt水平。

1.8 肺组织JAK1、JAK3、STAT1及STAT3 mRNA的RT-PCR检测

依据Trizol试剂说明书提取各组大鼠右肺组织总RNA，PCR试剂盒反转录合成cDNA并扩增目的基因，引物由上海生工生物工程有限公司合成，反应总体系为25µL。PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳确定其完整性，拍照并读取灰度值，分析JAK1、JAK3、STAT1及STAT3 mRNA转录水平变化情况（表1）。

1.9 统计学处理

图1 大鼠肺组织HE染色结果（×200）

所得实验数据使用SPSS 19.0软件进行分析，以均数±标准差（xˉ±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两间比较采用LSD-t检验。Pearson法相关性检验进行相关分析，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 大鼠肺组织形态学观察

对照组：支气管结构及肺泡结构清晰。支气管未见明显收缩，未见炎症细胞浸润，气道上皮排列整齐，管腔规则。模型组：支气管及肺泡组织结构紊乱，部分结构消失。支气管粘膜可见大量炎症细胞浸润，支气管出现收缩的现象，管腔变窄，气道上皮排列不整齐，甚至出现断裂的情况。益气固表丸组：较模型组的炎症细胞浸润减轻；支气管收缩好转；管腔变窄改善，管腔直径变宽（图1）。

正常组（A），模型组（B）和益气固表丸组（C）提示肺结构的组织学改变。模型组大鼠肺组织（箭头所示）主支气管结构紊乱和消失，存在广泛浸润的炎性细胞，支气管显示狭窄和痉挛状态，以及不规则和破裂的气道上皮（B）；益气固表丸组大鼠肺组织（箭头所示）显示使用益气固表丸等量水溶液干预后炎症细胞浸润减轻；支气管痉挛状态好转（C）。

2.2 酶联免疫吸附试验（ELISA）测定结果

与空白组比较，模型组IFN-γ水平降低（P＜0.05），IL-17a、IL-23及RORγt水平升高，有统计学意义（P＜ 0.05），益气固表丸组IL-17a、IL-23、IFN-γ及RORγt水平升高，有统计学意义（P＜ 0.05），与模型组比较，益气固表丸组IL-17a、IL-23、RORγt水平下降（P＜0.05），IFN-γ水平升高，有统计学意义（P＜0.05）（表2）。

2.3 实时-聚合酶链反应（RT-PCR）定量检测结果

与空白组比较，模型组及益气固表丸组JAK1、JAK3、STAT1及STAT3 mRNA水平均升高，有统计学意义（P＜0.05），与模型组比较，益气固表丸组JAK1、JAK3、STAT1及STAT3 mRNA均降低，有统计学意义（P＜ 0.05）（表3，图2）。

通过RT-PCR分析JAK/STAT通路中基因表达（A）为JAK1扩增曲线，（B）为JAK3扩增曲线，（C）为STAT1扩增曲线，（D）为JAK1扩增曲线，（E）为JAK1溶解曲线，（F）为JAK3溶解曲线，（G）为STAT1溶解曲线，（H）为STAT3溶解曲线

2.4 JAK1、JAK3、STAT1、STAT3 与 IL-17a、IL-23、IFN-γ及RORγt的相关性分析

JAK1、JAK3、STAT1及STAT3与IL-17a显著相关（P＜ 0.01），JAK1、JAK3、STAT1及STAT3与IL-23相关（P＜ 0.05），JAK1与IFN-γ呈负相关（P＜ 0.05），JAK3、STAT1与STAT3与IFN-γ无相关（P＞0.05），JAK1、JAK3、STAT1及 STAT3与 RORγt无相关（P＞ 0.05）（表4）。

3 讨论

气道炎症反应的持续状态是COPD过程中重要的病理状态[7]。JAK/STAT通路的激活与炎症因子的表达密切相关，多种细胞因子如干扰素受体家族（IFN-γ）以及白介素受体家族（白细胞介素IL-17a、IL-23）等，通过激活JAK/STAT通路，在COPD的发生发展过程中发挥的重要作用[8,9]。中医药通过调控STAT通路防治COPD的研究，逐渐显示出较大的潜力和广阔的应用前景，许光兰等[10]证实清金化痰颗粒能够抑制IL-6的水平的升高，下调JAK/STAT信号通路中STAT1，STAT3的过度表达和持续活化，从而减轻气道炎症，抑制COPD急性发作与加重。Wang C[11]发现六味补气胶囊可有效抑制JAK/STAT通路活性，明显提高了肺气虚型COPD稳定期患者的生活质量和肺功能。

熊斌等[12]认为“脾虚”对免疫功能的影响与JAK/STAT通路异常表达有关。因此，考虑能否通过中医的健脾的治法以改善免疫功能的异常，是现代中西医结合证治研究的关注点，益气固表丸是建立在“培土生金”治则上针对临床肺脾气虚证COPD相关病症患者的复方制剂，方中党参具有补中益气，健脾益肺之功效，为方中之君药，能够健运脾气之大统，辅以白术、茯苓，淡渗利湿以醒脾，薏苡仁利湿健脾，半夏、陈皮以行“二陈汤”之理气和中兼燥湿之功效，脾气得充则有化湿之力，浮小麦滋阴敛汗而清肺之虚热，以防子（肺）火乘母（脾）脏，防风入肝脾经，以祛风胜湿固表，余药以清利肺气，诸药共参，多种药物综合起效达到共奏“抑炎抗氧化”之效。本次研究通过益气固表丸的干预，研究JAK/STAT通路的活性，是本次研究的目的，试验发现模型大鼠外周血及肺组织中，炎性因子如：白细胞介素（IL-17a、IL-23）、RORγt水平升高，IFN-γ水平下降，STAT1、STAT3 mRNA表达显著高于正常组，IL-17a及IL-23是T淋巴细胞亚群的下游产物，考虑IL-17a及IL-23的升高与Th17Treg亚群失衡有关，提示COPD的病情进展与JKA/STAT通路的持续活化与其下游炎症蛋白过度表达密切相关，益气固表丸干预后可使上调的IL-17a、IL-23及RORγt水平下降，升高下调的 IFN-γ水平，同时升高 JAK1、JAK3、STAT1及STAT3 mRNA的表达，起到抑制JAK/STAT通路活性的作用，下一步的研究将通过研究T淋巴细胞亚群失衡情况，以了解JAK/STAT通路与Th17Treg比例的关系，以及相关中药对通路及淋巴细胞亚群的影响。相关性分析发现JAK1、JAK3、STAT1、STAT3的mRNA表达与IL-17a、IL-23成正相关，JAK1、JAK3与IFN-γ呈负相关，进一步证明IL-17a和IL-23具有强大的致炎性，是联系T细胞与中性粒细胞的重要介质，能够激活JAK/STAT通路，进一步肯定了炎性细胞因子在COPD病变过程中的作用。

表2 各组大鼠外周血IL-17a、IL-23、IFN-γ及RORγt水平的比较/ng·mL-1（ˉ± s）

表2 各组大鼠外周血IL-17a、IL-23、IFN-γ及RORγt水平的比较/ng·mL-1（ˉ± s）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组相比，P＜0.05。

RORγt 8.49±0.45 36.41±2.34*20.09±1.84*△520.013＜0.001分组空白组模型组益气固表丸组F P IL-17a 14.36±0.94 89.91±0.94*53.08±2.95*△1627.6＜0.001 IL-23 30.90±3.96 74.21±4.91*54.93±5.09*△172.165＜0.001 INF-γ 65.06±1.81 49.63±3.12*55.32±1.58*△94.405＜0.001

表3 各组大鼠肺组织JAK1、JAK3、STAT1及STAT3的比较/ng·mL-1（±s）

表3 各组大鼠肺组织JAK1、JAK3、STAT1及STAT3的比较/ng·mL-1（±s）

注：与空白组比较，*P＜0.01；与模型组相比，△P＜0.01。

STAT3 1.0±0.0 4.21±1.82*2.08±0.97*△11.267 0.001空白组模型组益气固表丸组F P JAK1 1.0±0.0 5.05±2.50*0.89±0.43*△15.76＜0.001 JAK3 1.0±0.0 4.08±0.97*3.13±0.71*△30.386＜0.001 STAT1 1.0±0.0 5.93±2.30*1.72±0.89*△20.932＜0.001

表4 JAK1、JAK3、STAT1及STAT3与IL-17a、IL-23、IFN-γ及RORγt的相关性分析/ng·mL-1

图2 JAK1、JAK3、STAT1及STAT3RT-PCR图形

4 结论

COPD模型大鼠肺组织中JAK/STAT通路处于激活状态，益气固表丸通过下调外周血中IL-23及IL-17a水平，升高IFN-γ水平，抑制肺组织中JAK/STAT通路中相关因子mRNA水平的表达，改善COPD模型大鼠气道炎症水平及病理学变化。