隔药灸对溃疡性结肠炎大鼠结肠NF-κB和STAT3活性的免疫调节机制＊

赵继梦，吴焕淦,，陆 嫄，顾沐恩，马 喆，刘雅楠，郑寒丹，刘慧荣,，马晓芃,＊＊，黄 艳,＊＊

（1.上海中医药大学上海市针灸经络研究所 200030上海；2.上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院 200437 上海）

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种慢性和复发性的炎症性肠病，发病率逐年升高[1，2]，UC的持续治疗至关重要，未经治疗的UC患者复发率高，长期反复发作的结肠炎症还有可能引起结肠炎相关性癌变[3，4]。尽管UC的发病机制尚未明确，但研究表明UC累及结肠上皮组织，激活黏膜及黏膜下层组织免疫细胞，产生过多的炎症相关的细胞因子[5]。UC免疫的失调与COX-2、iNOS、NF-κB、STAT家族和AP-1等炎症相关蛋白的上调密切相关[6，7]。核转录因子NF-κB在UC免疫调节中发挥关键作用[8]。在正常情况下，NF-κB作为一种核转录因子，在真核生物结肠上皮细胞中正常是RelA(p65)/p50二聚体形式，静息状态下NF-κB抑制因子α（IκB-α）和NF-κB形成复合体，存在细胞质[9]。炎症刺激致IκB蛋白被磷酸化、泛素化而水解，NF-κB转入细胞核中与DNA特异性位点结合，调节靶基因的转录，如促炎症反应的酶和细胞因子COX2、IL-1β、IL-6及TNF-α[10]。据报道，STAT3与结肠的免疫炎症密切相关，能激活大量的细胞因子和生长因子[11，12]。活化的转录因子STAT3被磷酸化，转入细胞核中能调节靶基因的转录，参与细胞凋亡、细胞周期进展与增殖和血管生成等生物学过程。NF-κB和STAT3之间还存在多种作用形式，未磷酸化的STAT3可直接取代NF-κB和IκB-α蛋白复合物中IκB-α的位置与RelA形成复合物，共同诱导基因的转录，STAT3增强NF-κB的活性并促使其向细胞核内转移；另外，NF-κB和STAT3也有可能未形成复合物，共同作用于基因的相同的启动子区域，共同调节基因的转录[13，14]。研究发现，在DSS诱导的小鼠结肠炎模型、活动性、非活动性UC患者结肠上皮组织固有层中，STAT3磷酸化水平均增加[15，16]。前期研究结果表明艾灸对UC患者有效[17-19]，其潜在的机制与抑制NF-κBp65有关，继而抑制炎性细胞因子和炎性介质的合成和分泌，发挥免疫抗炎效应[20-21]。因此，本研究从双转录因子NF-κB、STAT的角度，探讨艾灸对DSS诱导的UC大鼠结肠组织NF-κB信号通路、STAT3磷酸化的免疫调节机制。

1 材料与方法

1.1 动物分组及UC模型制备[22]

健康成年雄性SD清洁型大鼠26只，体质量200±20 g，由上海中医药大学动物实验中心提供[使用许可SYXK（沪）2012-0002]，动物饲养温度在20±2℃，湿度保持在50%-70%左右，12 h/12 h光照和黑暗交替，自由进食和饮水，适应性喂养1周后，随机分成2组，正常大鼠8只和造模大鼠18只，每天称量大鼠体重。18只造模大鼠连续自由饮用4%DSS（分子量：3.6-5万，MP Bio公司）水溶液7天，取2只大鼠进行HE染色，通过组织病理学进行模型鉴定。正常组（NC）8只，将造模成功的16只大鼠随机分成UC组（UC）8只和隔药灸组（HM）8只，自由饮用1%DSS水溶液7天维持。

1.2 艾灸干预措施

隔药灸于造模结束后开始，提前1天剔除腹部鼠毛。将药粉（附子、肉桂、木香等）按比例用黄酒调制呈厚糊状，用模具做成直径1 cm、厚0.5 cm的药饼。抓取大鼠并固定在自制大鼠固定器上，暴露双侧天枢穴，将配制好的药饼置于穴位上，上置艾炷施灸，每壮艾炷大小约90 mg，每次每穴灸2壮，每日1次，连续灸7天。穴位定位参照余曙光主编《实验针灸学》（人民卫生出版社，2016年第二版）。正常组和模型组给予相同的抓取和固定。

1.3 HE染色

切片常规脱蜡至水：二甲苯Ⅰ、Ⅱ各20 min，梯度酒精无水-95%-90%-80%-70%乙醇各5 min，双蒸水5 min×2次；苏木素浸染5 min，自来水流水冲洗10 min，1%盐酸酒精分化1-2 s，流水冲洗5 min，伊红浸染5 min；脱水透明：依次浸入上行梯度酒精：70%-80%-90%-100%乙醇各2 s；二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明各15 min；封片吹干后光学显微镜下观察大鼠结肠黏膜组织病理学变化。

1.4 ELISA检测

取出-80℃保存的血清，融化后混匀离心，按照IL-1β、IL-6的ELISA试剂盒（上海源叶生物科技有限公司）的步骤操作，标准孔中依次加入标准品，每孔50 μL，除了空白孔外，样本孔依次加入待测样本各10 μL，再加入样本稀释液各40 μL并混匀。将HRP标记的检测抗体各100 μL加入标准品孔和样本孔中，空白孔不添加，置于37℃恒温箱中温育60 min；洗板5次，并在滤纸上充分印干。每孔依次加入底物A和B各50 μL，置于37℃恒温箱中避光孵育15 min；每孔加入终止液50 μL。用全波段酶标仪检测，根据标准品换算出样本的浓度。

1.5 Western Blot检测

取出-80℃保存的结肠组织，匀浆后加RIPA裂解液冰上放置10 min，15000 rpm 10 min离心取上清；采用BCA蛋白定量法测定浓度，调整各样本浓度一致变性后，经电泳-转膜-封闭后，分别加入一抗p-STAT3Tyr705（1:2000，CST美国）、STAT3、IκB-α、NF-κBp65、α-tubulin和GAPDH（1:1000，CST 美国）、pIκB-α（1:1000，Santa Cruz Biotechnology，美国）4℃孵育过夜，TBST洗膜后，分别加入对应的二抗（兔抗或鼠抗）室温孵育1 h，凝胶成像系统拍摄条带图，使用Image Pro Plus软件分析灰度值。

1.6 统计学分析

采用SPSS 22.0统计软件，所有计量资料均用均数±标准差（xˉ±s）表示，符合正态分布的数据采用单因素方差分析比较组间差异，不符合正态分布的数据采用非参数检验，检验水准α=0.05，P＜0.05差异有统计学意义。

图1 各组大鼠结肠组织病理学变化

图2 各组大鼠血清IL-1β和IL-6的蛋白浓度的比较

2 结果

2.1 隔药灸对DSS诱导的UC大鼠的组织病理学观察

正常组的结肠黏膜上皮完整，无溃疡发生，各层组织结构清晰，腺体排列整齐，黏膜层仅见少量炎症细胞浸润，间质无充血水肿；UC组的大鼠结肠黏膜上皮不完整，有溃疡面，黏膜层腺体减少，杯状细胞明显减少，间质中及黏膜下层见大量淋巴细胞、浆细胞、中性粒细胞浸润；与UC组比较，隔药灸组的大鼠结肠黏膜可见愈合性溃疡，黏膜层腺体增加，杯状细胞明显增多，黏膜及黏膜下层可见少量淋巴细胞、中性粒细胞浸润（图1）。

2.2 隔药灸对DSS诱导的UC大鼠血清IL-1β、IL-6蛋白浓度的影响

与正常组比较，UC组的大鼠血清IL-1β、IL-6蛋白浓度均显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）；与UC组比较，隔药灸组大鼠血清IL-1β、IL-6蛋白浓度均显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）（图2）。

2.3 隔药灸对DSS诱导的UC结肠组织STAT3磷酸化和NF-κB通路蛋白表达的影响

与正常组比较，UC组结肠组织STAT3被磷酸化而激活；与UC组比较，隔药灸组结肠组织p-STAT3磷酸化水平显著降低（图3）。

与正常组比较，UC组结肠组织NF-κB通路中磷酸化pIκB-α和NF-κB p65蛋白表达均显著增加，IκB-α蛋白表达显著降低；与UC组比较，隔药灸组NF-κB p65和磷酸化pIκB-α蛋白表达均显著降低，IκB-α蛋白表达显著增加（图3）。

3 讨论

图3 各组大鼠结肠组织STAT3磷酸化和NF-κB通路蛋白表达的比较

溃疡性结肠炎临床表现为腹泻、腹痛及粘液脓血便等症状，病情持久难愈，且易反复发作，与克罗恩病共称为炎症性肠病。根据主症，当属中医学“腹泻”、“便血”、“久泻”、“久痢”、“肠癖”等病症范畴。课题组前期采用灸补脾胃调和阴阳法治疗溃疡性结肠炎，灸法常取隔药灸，药饼主要成分为附子、肉桂、丹参、红花、木香等，有温阳散寒和行气止痛的作用，主穴天枢穴是大肠之募穴，属足阳明胃经，可疏调肠腑、理气行滞、消食[22-24]，艾灸天枢穴可改善肠腑功能，缓解肠道功能失常而导致的各种证候，是腹部要穴[16，25，26]。前期研究表明，艾灸在临床治疗溃疡性结肠炎患者中取得了显著的疗效，其作用机制与艾灸的抗炎免疫调节机制有关[21，27，28]。本研究采用 DSS诱导的UC，能很好复制溃疡性结肠炎的症状，是UC机制研究中最常用的动物模型，其血清中IL-6及IL-1β等促炎症因子的蛋白浓度显著上调，结肠组织HE染色观察组织病理学，发现结肠上皮不完整，有溃疡形成，黏膜和黏膜下层有明显的炎症反应；采用隔药灸干预UC大鼠，其结肠组织病理学观察发现，隔药灸能减轻UC大鼠的结肠炎症，促进肠黏膜上皮修复，杯状细胞明显增多，可降低UC大鼠血清异常增高的IL-6、IL-1β蛋白浓度，从而减轻肠道炎症反应，提示隔药灸能缓解DSS诱导的UC大鼠结肠炎症反应，抑制结肠促炎症性因子IL-6、IL-1β的释放。

IBD患者结肠黏膜组织中明显增加的促炎症性因子（IL-6、IL-1β）受活化的转录因子调节（如STAT3和NF-κB）。在这项研究中，隔药灸能抑制DSS诱导的结肠炎小鼠中NF-κB和STAT3 Tyr705的活化和核转位。大量研究表明，活化的STAT3和NF-κB能促进细胞增殖和血管生成，并上调靶基因（如IL-6、IL-1β）的表达[9，10，29]。IL-6 的刺激可活化 STAT3 的组分，STAT3和NF-κB作用于基因的相同的启动子区域，共同调节相关细胞因子和趋化因子的 mRNA 转录[9，14，30，31]。UC大鼠结肠在炎症刺激下，IκB-α发生磷酸化而水解，促NF-κB和转入细胞核内，与靶基因的启动子区域结合，上调相关靶基因，激活T辅助细胞免疫应答，进而参与炎症反应。据报道，STAT3可直接与p65和p50相互作用，促进NF-κB募集至STAT3启动子，反之亦然。NF-κB的RelA的下游基因编码的因子能激活STAT3通路；STAT3可通过募集p300组蛋白乙酰转移酶与RelA结合，干扰NF-κB和IκB-α复合物的形成，持续激活炎症相关的基因[32]。STAT3和NF-κB之间的激活和串扰，通常是慢性炎症作用的结果，特别是T辅助细胞。且NF-κB和STAT3通路已作为溃疡性结肠炎的潜在治疗靶点。本研究结果提示，STAT3 Tyr705的磷酸化与DSS诱导的小鼠的溃疡性结肠炎有关，说明STAT3活性依赖于酪氨酸磷酸化，而隔药灸可降低UC结肠组织STAT3酪氨酸磷酸化水平。近期研究表明DSS诱导的结肠炎症与STAT3Tyr705密切相关，STAT3的丝氨酸磷酸化与JAK活性和STAT3酪氨酸磷酸化无关[7，33]。综上所述，本研究结果提示，隔药灸可能通过调节NF-κB信号通路和STAT3的激活，减少血清促炎症因子IL-6、IL-1β的释放，达到减轻DSS诱导的溃疡性结肠炎症反应。该结果为临床进一步应用隔药灸治疗溃疡性结肠炎提供了客观的科学依据。