顶空-气相色谱-飞行时间质谱鉴定分析饮用水中的异味成分

蒋万枫, 张 宁, 张辉珍

(青岛市食品药品检验研究院, 山东 青岛 266071)

水被称为人类生命的源泉,是包括人类在内所有生命生存的重要资源,也是生物体最重要的组成部分。饮水安全关系着亿万百姓的健康和生命安全[1]。水在常温常压下为无色无味的透明液体,但在生产加工或存储过程中可能会产生异味,饮用水中出现异味虽然不一定会对消费者造成直接的健康危害,但是容易引起消费者的恐慌和对水质的怀疑[2]。《食品安全国家标准包装饮用水》(GB 19298-2014)、《食品安全国家标准饮用天然矿泉水》(GB 8537-2018)感官要求中的滋味、气味项目均为无异味、无异嗅。

顶空-气相色谱是在已达到平衡的密闭容器中液体或固体分析物的顶部空间取气态(或蒸气)样品,并与气相色谱结合对气态(或蒸气)样品进行分析的一种比较特殊的分析技术[3]。飞行时间质谱具有高分辨能力、高采集速率、精确质量全谱采集等特点[4]。这两项技术已广泛应用于风味成分分析[5-11]。差异化分析软件基于质谱数据的差异分析,以确定样品组和变量之间的关系,已广泛应用于食品鉴定分析中[12-15]。本文利用顶空-气相色谱的高分离能力、飞行时间质谱的高分辨力和差异化分析软件的高效数据分析能力,对消费者投诉的具有异味的饮用水进行鉴定分析,确定其中的异味成分,分析产生的原因,并对相应的生产加工工艺提出合理化建议。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

Agilent7890A-7250型气相色谱-飞行时间质谱、COMBI PAL型全自动三位一体进样器、20 mL顶空瓶、Mass Hunter定性定量分析软件、Mass Profiler Professional (MPP)差异化分析软件(美国Agilent公司); AL 204天平(瑞士梅特勒特里多公司); NIST谱库(美国国家标准与技术研究院);超纯水机(德国赛多利斯公司)。氯化钠(分析纯)、无水硫酸钠(分析纯)、乙醛标准溶液(1 000 mg/L)(英国LGC公司)。

1.2 差异化分析实验方法

1.2.1顶空进样条件

样品量:10 mL;进样加热箱温度:70 ℃;进样针温度:80 ℃;样品加热同时振摇频率:500 r/min;平衡时间:20 min;进样量:500 μL。

1.2.2色谱条件

色谱柱:DB-1MS柱(30 m×0. 25 mm×0. 25 μm,美国Agilent公司)。升温程序:初始温度50 ℃,保持1 min,以5 ℃/min的速度升温至245 ℃,保持5 min;进样口温度:250 ℃;进样模式:脉冲分流进样;脉冲压力:103.4 kPa;分流比:20∶1,持续0.5 min;载气:高纯氦气;恒流流速:1.0 mL/min。

1.2.3质谱条件

传输线温度:280 ℃;电离模式:EI源;数据采集方式:飞行时间质谱(TOF MS);质量扫描范围:m/z40～800;溶剂延迟时间:0 min;采集速率:3.00 spectra/s。

1.3 乙醛测定方法

1.3.1顶空进样条件

样品量:12 mL;进样加热箱温度:80 ℃;进样针温度:90 ℃,样品加热同时振摇频率:500 r/min;平衡时间:20 min;进样量:750 μL。

1.3.2色谱条件

色谱柱:DB-1MS柱(30 m×0. 25 mm×0. 25 μm);升温程序:初始温度50 ℃,保持3 min,以20 ℃/min的速度升温至150 ℃,保持5 min;进样口温度:250 ℃;进样模式:脉冲分流进样;脉冲压力:103.4 kPa;分流比:10∶1;持续0.5 min;载气:高纯氦气;恒流流速:0.8 mL/min。

1.3.3质谱条件

传输线温度:280 ℃;电离模式:EI源;数据采集方式:TOF MS,质量扫描范围:m/z40～400;溶剂延迟时间:2.3 min;采集速率:3.00 spectra/s。

2 结果与讨论

2.1 差异化分析数据准备

分别取5个带有异味的水样品和4个无异味的水样品,按1.2节方法分别检测。由于异味物质含量低,无法从总离子流图(见图1)直接看出其差异性,找到异味物质,需要进行“分子特征提取(MFE)”,通过分子特征提取色谱图中的各化合物,将这些化合物导入MPP软件,设置最小绝对丰度为10 000,所需离子数为2,保留时间偏差为0.1 min,精确计量数偏差为20 ppm(10-6,下同),进行化合物比对,从这9个样品中共分析出124种不同化合物,将这些化合物的信息导出为CEF格式文件,导入到Mass Hunter定性分析软件中,再次检查色谱图,用“分子式查找化合物”工具专门搜索这些化合物,然后将得到的化合物返回到MPP软件中,进行第二轮化合物比对和过滤,防止在分子特征提取过程中遗漏化合物。

图 1 有异味水和无异味水的总离子流图Fig. 1 Total ion chromatography (TIC) of non-odorous and odorous water

2.2 差异化分析

在MPP软件中,对导入的数据进行主成分分析,从主成分分析图(见图2)上可以看出,在无监督模式下有异味水和无异味水不能在3D图上很好地区分开,说明2种水主成分差异不明显。

图 2 有异味水和无异味水的主成分分析图Fig. 2 Principal component analysis of odorous and non-odorous water

分别采用按标志筛选、按频率筛选、按变异系数筛选等进行处理,通过逐级筛查,化合物数量降低。在有监督模式下,逐级筛选出有异味水和无异味水的差异化合物。通过T检验统计分析查找差异明显的化合物,一般认为P<0.05差异显著。同时计算倍数变化(fold change),用标准化后的两组数据相除得到倍数,一般2倍表明两组数据有显著差异。火山图可反映两种水中化合物的差异情况,其横坐标代表log2(fold change),纵坐标表示-log10(P值),每个点代表一个化合物。从火山图(见图3)中明显看出两种水之间的2个差异化合物,经NIST谱库检索和结构解析,其中一个化合物为二氧化碳,另一个化合物为乙醛。二氧化碳为无色无味气体,所以初步确定异味物质为乙醛。

图 3 (左)有异味水和(右)无异味水的差异火山图Fig. 3 Differential volcanoes of (left) odorous and (right) non-odorous waterLeft and right bounded by abscissa 0.

从质谱图(见图4)可以看出,m/z44.025 7、43.017 9、42.009 9、45.029 0分别为乙醛的M+、[M-H]+、[M-2H]+和其中一个碳为13C的同位素离子,另外m/z43.989 3、44.992 7分别为CO2离子及其同位素离子,所有离子质量偏差均在5 ppm内(见表1和图4)。乙醛和二氧化碳分子离子的精确质量数相差0.036 4 Da,在飞行时间质谱上能轻易分开,提取m/z44.025 7,窗口为10 ppm,可看出乙醛在有异味的水和无异味水中的含量有明显差别(见图5)。经与乙醛标准品对照,其保留时间和特征离子均一致,经食品感官品评员鉴别有异味水的气味和滋味与乙醛标准品的水溶液相同,确认异味成分为乙醛。

图 4 样品中异味物质的质谱图解析Fig. 4 Mass spectrographic analysis of odorous substances in samples

Molecular formulaIon speciesTheoretical m/zMeasured m/zOffset/ppm (10-6)C2H2O[M-2H]+42.010042.00992.76C2H3O[M-H]+43.017843.0179-1.37C2H4OM+44.025744.02570.00C13CH4OM+45.029045.02900.00CO2M+43.989343.98930.00C13CO2M+44.992644.9927-1.43

图 5 有异味水和无异味水中乙醛的质谱图Fig. 5 Mass spectrum of odorous and non-odorous water

2.3 乙醛检测方法优化

在上述鉴定异味水中异味物质的过程中,所采用的试验方法并非针对乙醛建立的。因而不是最优的方法,为提高方法的检出限,需要针对乙醛对方法进行优化。顶空处理实验中通常在水溶液中加入盐类物质,以此降低有机物在水中的溶解度,提高顶空富集效率,氯化钠与硫酸钠是最常使用的盐类,所以本试验选取了这两种盐进行对比。一般情况下,加入的盐越多,顶空富集效率越高,响应值越高。在初始选择加入盐的种类时,分别加入饱和氯化钠和饱和硫酸钠,即分别在10 mL样品中加入3.6 g氯化钠和4.0 g硫酸钠,考察其影响,结果表明,加入硫酸钠的样品响应值较大。除盐效应外,影响顶空响应的因素还有加热时间、加热温度、样品量和加盐量,为此设计了一个四因素三水平的正交试验,从试验结果(表2)可以看出,响应值随样品量和温度的升高而增加,随时间的延长先增加后下降,随加盐量增加而减少。所以最终确定方法为样品量为12.5 g,加热温度为80 ℃、加热时间20 min,加入硫酸钠的量为2 g。

表 2 乙醛检测方法正交试验优化结果表

2.4 方法学验证

将乙醛标准溶液配成0.010、0.020、0.050、0.100和0.500 mg/L的标准系列,按优化好的乙醛检测条件进行检测,以乙醛的峰面积(y)为纵坐标,以对应的质量浓度(x, mg/L)为横坐标,在0.010～0.500 mg/L范围内,求得线性回归方程y=1.05×105x-1.34×104,相关系数R2=0.997。按照样品分析的全部步骤,根据GB/T 27404-2008附录F的要求重复20次测定空白样品,计算20次平行测定的标准偏差S,按3倍和10倍标准偏差计算乙醛的检出限和定量限分别为0.003 3和0.010 mg/L。

2.5 样品加标回收率及精密度

向水样中分别加入0.020和0.050 mg/L乙醛标准溶液,用1.3节方法进行测定,平行测定6次,低浓度平均回收率为91.3%,高浓度平均回收率为94.8%。日间精密度为1.70%～8.72%,日内精密度为0.17%～9.85%。

2.6 实际样品检测

对市场上销售的11种饮用水进行了乙醛检测,其中9种聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)瓶装水中乙醛的含量为0.017～0.075 mg/L不等,聚碳酸酯(PC)桶装水未检出乙醛(见表3)。影响乙醛产生的因素有加热时间、加热温度、粒料湿度等,另外,储存温度和光照也会影响乙醛从瓶到水的迁移速度[16,17], PET在高温下热氧化降解后易产生乙醛。不同文献报道的乙醛的阈值(人的嗅觉或味觉能够感知到的最低浓度)不同,在空气中的阈值有0.001 3 ppm(10-6)和0.018 ppm[18],清水中的阈值为0.032～0.500 mg/L[19]。经过本实验室的比较,认为其在饮用水中的阈值为0.030 mg/L,超过此数值气味比较明显,能够很容易分辨出来。PET在制胚和吹瓶过程中均有加热工艺,为分析乙醛是在哪个过程中产生的,分别取5 g粒料、瓶胚和瓶,用液氮冷冻后粉碎,顶空加热80 ℃,保持20 min,用气相色谱-飞行时间质谱检测乙醛的响应值,峰面积分别为59 906、11 479 432、11 784 644,可以看出乙醛主要来自制胚过程,建议生产厂家优化制胚参数,改善生产加工工艺,降低乙醛的产生,保证饮用水质量安全。

表 3 饮用水中乙醛的含量

PET: polyethylene terephthalate; PC: polycarbonate.

3 结论

使用顶空-气相色谱-飞行时间质谱分别采集有异味和无异味的饮用水,通过差异化分析软件鉴定分析出了异味化合物,利用结构解析确定为乙醛。建立了三水平四因素的正交试验,对样品量、顶空温度、顶空时间、样品中加盐量等试验条件进行了优化,确立的方法具有较低的检出限,较高的精密度和准确度。通过实际样品的检测数据,分析出了产生异味的原因,并对相应的生产加工工艺提出了合理化建议。