液相色谱-串联质谱法测定百日咳和百白破疫苗中百日咳杆菌气管细胞毒素

龙 珍, 卫 辰, 郭志谋, 马 霄, 李月琪, 姚劲挺, 冀 峰, 李长坤, 黄涛宏

(1. 岛津企业管理(中国)有限公司, 北京 100020; 2. 中国食品药品检定研究院, 卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室, 北京 102629; 3. 中国科学院分离分析化学重点实验室, 中国科学院大连化学物理研究所, 辽宁 大连 116023)

百白破(DTP)疫苗由百日咳疫苗、白喉疫苗和破伤风疫苗联合组成,是全球范围内应用最广的疫苗之一,同时也是报道不良反应次数最多的疫苗。2015年,百白破疫苗不良反应约占中国疫苗不良反应的三分之一[1]。百日咳杆菌气管细胞毒素(TCT)最早由Goldman等[2]从百日咳杆菌培养液中发现,它的存在被认为是导致百日咳和百白破疫苗不良反应的原因之一。在呼吸道上皮细胞培养实验中发现,浓度为1 μmol/L的TCT即可摧毁纤毛细胞群[2]。当纤毛细胞被破坏以后可以产生类似百日咳的症状,如咳嗽甚至肺部感染[3]。由于TCT的高活性和破坏力,各国药典均对百日咳疫苗中TCT的最高含量做出了限定,即不得超过2 pmol/剂。按照通常百白破疫苗的体积(0.5 mL)计算,TCT在成品中不得超过4 nmol/L。

尽管各国药典均对TCT的含量做出了限定,但由于无商品化TCT对照品、TCT对照品制备困难和缺乏高灵敏度、高选择性的TCT检测方法等原因,目前各国药典均无TCT的检测方法记载。TCT无强紫外吸收基团且易受疫苗基质干扰,即使采用低波长检测,仍然无法实现复杂疫苗基质中TCT的高灵敏度准确检测。例如,以204 nm为检测波长,进样10 μL浓度为4 nmol/L的TCT对照品,无明显紫外吸收峰检出。Goldman等[4]将柱前衍生-HPLC-UV方法用于疫苗中TCT的含量测定,该方法在进样200 μL时,可实现浓度为5 nmol/L TCT的检测,该方法灵敏度与药典要求尚存在一定差距,且方法耗时较长(45 min)。此外,衍生效率受基质和衍生试剂干扰,从而影响定量的准确性、重复性和再现性[3],不能实现疫苗中TCT的高灵敏度、高选择性、高准确度检测,且定量所需消耗的对照品质量较多,增加了TCT对照品制备的工作量。通用型检测器为紫外检测器的有利补充,无需衍生即可实现弱紫外吸收和无紫外吸收化合物的检测[5-8]。但通用型检测器的灵敏度通常在mg/L级别,无法满足各国药典对TCT含量检测的限量要求。更重要的是,无论是紫外检测器还是通用型检测器均需要对照品,通过对比样品和对照品保留时间定性。目前尚无商品化的TCT对照品,且TCT对照品的制备复杂。通过48 h培养、纯化1 L TCT培养液最多只能制备得到700 nmol的TCT对照品[2]。

为了实现疫苗中TCT的有效定性和定量分析,需要发展一种无须衍生、灵敏度好、选择性较高、适合百日咳和百白破疫苗中TCT的快速检测的方法。本文发展了一种亲水作用色谱(HILIC)-MS/MS方法用于百日咳和百白破疫苗中TCT的定性和定量分析。从百日咳杆菌培养液中纯化得到TCT样品后,通过LC-离子阱飞行时间质谱表征确定其结构后作为对照品,用于HILIC-MS/MS定量方法的发展。系统优化了TCT检测的色谱条件和MRM参数,并对方法的重复性、回收率、线性关系、检出限(LOD)和定量限(LOQ)等进行了考察。方法优化后,将其用于两种主流工艺(共纯化和组分)所得百日咳和百白破疫苗中TCT的检测。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

LC-MS/MS系统包括LCMS-8045三重四极杆质谱、LC-20ADXR高压二元泵、脱气机、SIL-30AC自动进样器、CTO-20AC柱温箱、SPD-M30A紫外检测器,用于TCT的定量。LCMS-IT-TOF系统用于TCT的结构确定。LCMS-8045和LCMS-IT-TOF均使用ESI离子源并同时监测正、负离子模式。LabSolutions和LCMSSolution工作站分别用于LCMS-8045和LCMS-IT-TOF的数据处理。以上仪器和软件购自岛津(京都,日本)。

乙腈、甲酸和低吸附离心管购自Merck (MA, USA)。超纯水由Milli-Q系统制备(Millipore, USA)。HILIC色谱柱Click XAmide (150 mm×2.1 mm, 3 μm)由中国科学院大连化学物理研究所提供。QMA柱为购自Waters的阴离子交换固相萃取柱。共纯化百日咳疫苗(厂家1和2)、组分百日咳疫苗(厂家3和4)、组分百白破疫苗(厂家5和6),共纯化百白破疫苗(厂家7、8和9)和疫苗基质(百日咳和百白破疫苗基质)由中国食品药品检定研究院提供。

表 1 MRM模式下TCT的MS/MS参数

CE: collision energy. *Quantitative ion.

1.2 溶液配制、TCT对照品的制备

QMA柱所用平衡液和洗涤液均为含有10 mmol/L乙酸铵的甲醇水溶液(pH 5.5),其中甲醇与水的体积比为2∶8。QMA柱洗脱液为含有10 mmol/L乙酸铵、1 mol/L氯化钠的甲醇水溶液(pH 5.5),其中甲醇与水的体积比为2∶8。TCT对照品参考文献[2]的方法制备,具体步骤如下。(1)纯化:百日咳杆菌培养液在4 ℃下采用高速离心的方法去除大分子杂质,取上清液过0.22 μm醋酸纤维素膜进一步去除溶液中的大分子杂质,收集滤液,用三氟乙酸调节滤过液pH值至3。(2)C18柱纯化TCT:用甲醇和体积分数为0.1%的三氟乙酸水溶液依次洗涤C18填料;将洗涤后的C18填料填装在玻璃柱中,然后注入纯化步骤所得滤液;抽干柱中溶液,再用体积分数为0.1%的三氟乙酸水溶液洗涤色谱柱;用三氟乙酸-正丁醇-水(1∶200∶800, v/v/v)溶液洗脱TCT并收集馏分;减压浓缩馏分以备QMA柱纯化。(3)深度纯化:用平衡液浸润QMA柱10 min,再用20 mL洗涤液清洗QMA柱,再用20 mL甲醇清洗QMA柱,最后用20 mL平衡液平衡QMA柱。将减压浓缩所得馏分注入QMA柱,再用洗涤液洗涤未结合蛋白质,然后用洗脱液洗脱TCT并收集。(4)脱盐:用三氟乙酸酸化第(3)步所得TCT溶液至pH为3,再按富集步骤的操作流程上样并收集TCT脱盐馏分,冻干TCT脱盐馏分,得TCT对照品,称重后放置于-80 ℃保存。

1.3 疫苗样品的前处理

向疫苗样品中加入乙腈,直到乙腈体积分数为80%,充分振荡、混合样品1 min后,置于离心机中以14 000 r/min离心15 min。取上清液用于LC-MS/MS分析。处理前和处理后疫苗样品均放置于4 ℃保存。

1.4 HPLC条件

LCMS-IT-TOF定性分析TCT与LCMS-8045定量分析TCT的HPLC条件相同。进样体积为10 μL;色谱柱:Click XAmide (150 mm×2.1 mm, 3 μm);流动相A为10 mmol/L甲酸铵水溶液(pH 3.0),流动相B为10 mmol/L甲酸铵乙腈溶液(每升含100 μL甲酸)。流速为0.3 mL/min;梯度:0～5 min, 75%B～20%B; 5～5.1 min, 20%B～75%B; 5.1～9 min, 75%B。0～2 min的色谱柱洗脱液由六通阀切换至废液,其余切换到MS检测。

1.5 MS条件

TCT定性:离子源为电喷雾电离源,正离子模式;离子化电压为3.5 kV;雾化气流速为1.5 L/min;加热模块温度为200 ℃;脱溶剂管(CDL)温度为235 ℃;检测器电压为1.70 kV; TOF飞行管温度为(40.0±0.3) ℃;质谱数据采集范围m/z300～1 500;三氟乙酸钠(NaTFA)溶液用于正负离子模式校正。

TCT定量:离子源为电喷雾电离源,正离子模式;扫描模式为多反应监测(MRM)模式;离子化电压为3.0 kV;离子源温度为300 ℃;脱溶剂管(DL)温度为235 ℃;雾化气流速为3 L/min;干燥气流速为10 L/min;加热器流速为10 L/min。TCT的3个离子对通道用于TCT分析(见表1)。

1.6 标准溶液

将对照品制备步骤中所得TCT对照品(0.1 mg)用1 mL水溶解,配制成质量浓度为100 μg/L的TCT母液。取TCT母液,用疫苗基质逐级稀释成质量浓度为369、184.5、92.25、46.13、23.06、11.53、5.76 ng/L,进样10 μL,获取线性曲线。

LOD和LOQ测试溶液配制方法如下:取质量浓度为5.76 ng/L的TCT溶液,用疫苗基质稀释成质量浓度为2.88 ng/L和0.74 ng/L。

2 结果与讨论

2.1 TCT对照品的结构鉴定

由于尚无商品化的TCT对照品,在发展TCT定量方法前需制备TCT对照品。根据文献[2]方法制备、纯化得到TCT样品后用LCMS-IT-TOF鉴定其结构。根据LCMS-IT-TOF的一级质谱数据(图1a)结合formula predictor软件测得TCT分子式为C37H59N7O20,该结构与文献[2]报道一致。由于所得TCT对照品质量较少(0.1 mg)且TCT固体对照品容易吸水(核磁氢谱中受水峰影响较大),难以实现用核磁共振测试其纯度,本文采用质谱和紫外光谱法辅助测试样品纯度。在m/z100～2 000范围内和在200～400 nm范围内分别获取TCT总离子流图(图1c)和紫外光谱图(图1d),其中210 nm处的色谱图见图1d。从图1c可以看到,除TCT主峰以外,无其他杂质峰检出。如图1d所示,TCT样品中无杂质峰检出。由于TCT紫外吸收弱,低浓度TCT也无法被紫外检测器检出。

图 1 LCMS-IT-TOF所得TCT的(a)一级质谱图、(b)二级质 谱图、(c)总离子流图以及(d)TCT对照品的紫外光谱图Fig. 1 (a) MS spectrum, (b) MS2 spectrum, (c) total ion chromatogram of TCT obtained by LCMS-IT-TOF and (d) UV/Vis chromatogram of TCT Injecting 10 μL 1 mg/L TCT to obtain total ion chromatogram of TCT in the range of m/z 100-2000. Injecting 10 μL 0.1 mg/mL TCT to obtain 3D UV/Vis spectrum of TCT in the wavelength range of 190-400 nm.

2.2 色谱条件优化

2.2.1色谱模式的选择

由于大分子化合物(如疫苗中的铝佐剂、蛋白质等)容易堵塞分离系统,污染色谱柱,导致系统压力升高、保留时间漂移和色谱峰变形,因此需要采用适当的前处理步骤将其去除。蛋白质沉淀技术(PPT)[9]是常用的蛋白质沉淀和铝佐剂去除方法。PPT处理后的样品通常溶解在高浓度有机溶剂中。在反相分离(RPLC)模式中,高浓度有机溶剂为强洗脱溶剂,以高浓度有机溶剂为样品溶剂容易造成RPLC分离色谱峰分叉、变形甚至穿透等溶剂效应现象[10-12]。在HILIC模式中高浓度有机溶剂为弱洗脱溶剂[13],不但没有RPLC分离出现的溶剂效应,当HILIC分离初始流动相中有机相比例低于样品溶剂中有机溶剂比例时,还具有柱头富集的作用。虽然TCT在RPLC和HILIC模式中均可保留,但HILIC模式具有与PPT处理溶剂兼容性的优点。因此,选择HILIC模式用于疫苗中TCT的分离。

2.2.2流动相组成的优化

图 2 不同流动相组成下TCT的MRM图Fig. 2 MRM chromatograms of TCT obtained with different mobile phases Ammonia format buffer: a. 5 mmol/L ammonia format (pH 5.0); b. 5 mmol/L ammonia format (pH 3.5); c. 10 mmol/L ammonia format (pH 3.5). Mobile phase A: ammonia format buffer; mobile phase B: ammonia format buffer in acetonitrile. Flow rate: 0.3 mL/min. Gradient: 0-5 min, 75%B-20%B; 5.0-5.1 min, 20%B-75%B; 5.1-9.0 min, 75%B.

本文考察了流动相pH值(3.0～6.3)、缓冲盐浓度(5～20 mmol/L)和初始乙腈体积分数(85%～60%)对TCT保留行为的影响,如图2所示。随着流动相中pH的增加,TCT保留增强且呈现拖尾峰(图2a), pH过低不利于色谱柱的长期稳定性,综合考虑选择pH 3.5用于TCT分离。pH 3～4是甲酸铵的常用缓冲范围,故选择甲酸铵作为缓冲盐。流动相中缓冲盐浓度的增加可增加亲水层的极性,增强化合物的亲水保留,但同时降低离子交换保留和增加MS检测背景噪音。本文选择10 mmol/L甲酸铵作为TCT分离的缓冲盐浓度,该浓度相对于5 mmol/L甲酸铵(图2b)作流动相添加剂无明显MS背景增加[12],且TCT峰形更为对称、柱效更高(图2c),有利于提高检测灵敏度。随着初始流动相中乙腈含量的减少,TCT保留变弱,因此确定初始流动相中乙腈的体积分数为75%,并在5 min内线性降低到20%。该起始体积分数(75%)低于PPT处理所得样品中乙腈的体积分数(80%),可避免溶剂强度带来的溶剂效应[14]。如图2c所示,TCT在乙腈体积分数约为36%时从色谱柱洗脱,该体积分数高于C18分离TCT时所用乙腈含量(20%)。当乙腈体积分数低于80%时,随着乙腈体积分数的增加,可有效增加雾化效率[15],从而提高检测灵敏度。

2.3 TCT定量分析时质谱条件的优化

首先在m/z100～2 000范围内,采用ESI+扫描方式获取TCT对照品的一级质谱图(见图3a)。从一级谱图中得到TCT的[M+H]+为m/z922.4。在10～50 eV碰撞能范围内获取TCT的产物离子谱图,选择多种碰撞能下均可获得且响应最高的3种产物离子作为TCT的MRM监测通道,在这3个通道中,选择信噪比最高的离子对m/z922.4→719.3作为定量离子对,其他两个通道m/z922.4→391.1和922.4→302.1作为参比离子通道用于TCT定性筛查,MRM谱图见图3。在确定监测离子对后,采用自动优化模式对各离子对的碰撞能、Q1电压和Q3电压进行优化,优化结果见表1。

2.4 方法学考察

本文从选择性、样品残留、LOD、LOQ、重复性、定量准确度和线性范围对发展的LC-MS/MS方法进行了考察。

2.4.1选择性

将LC-MS/MS方法用于疫苗基质的分析,在TCT出峰处无明显信号峰(见图3c),表明该方法不受样品处理溶剂和疫苗基质的干扰,可在复杂的疫苗基质中选择性检测TCT,是一种高选择性的分离检测方法。

2.4.2样品残留

用LC-MS/MS方法分析高浓度TCT对照品(369 ng/L),随后进空白溶剂分析,在TCT出峰处无明显MRM信号峰检出,表明该方法无明显残留(见图3d)。空白溶剂为乙腈:水(8∶2, v/v)。因此,该方法可用于较宽浓度范围内样品的分离检测,高浓度样品分析后无需增加色谱柱和系统的清洗步骤,即可实现低浓度样品的分离检测。

2.4.3LOD和LOQ

将常见的两种获取多肽LOD的方法(理论计算和实验验证)用于TCT的LOD测定。

理论计算:采用Keshishian等[16]报道的统计学公式LOD=Mb+t0.95(SDb+SDs)/n进行计算。其中,Mb和SDb分别为空白样品的平均偏差和标准偏差,SDs为线性曲线最低浓度点样品的标准偏差,t0.95是样本量n=4时的t分布值。LOQ=3×LOD。经测试和计算得到本方法的LOD和LOQ分别为0.72 ng/L和2.88 ng/L。

实验验证:配制理论计算所得LOD和LOQ对应浓度的TCT对照品溶液进样测试,结果显示质量浓度为0.72 ng/L和2.88 ng/L的TCT的信噪比(S/N)分别为3.2和13.4。

结合柱上样量,对比本方法和文献中灵敏度最高的柱前衍生-HPLC-UV方法[2](进样200 μL, LOQ为1 408.5 ng/L),本方法的灵敏度比文献方法[2]高9 781倍。药典规定疫苗中TCT含量不得超过2 pmol每剂。按照通常疫苗体积0.5 mL计算,药典控制浓度应为3 684 ng/L。本方法的LOQ (2.88 ng/L)是药典要求疫苗中TCT最高残留量的1/1 279。此外,该方法仅需9 min(含色谱柱平衡)即可完成一个样品中TCT的检测,与柱前衍生-HPLC-UV方法(45 min)[2]相比,具有更高的检测通量。

2.4.4线性曲线

配制质量浓度从5.76 ng/L到369 ng/L范围内的TCT对照品溶液,共7个浓度样品,每个浓度样品进样3次。将每个浓度所得TCT的峰面积(y)与对应质量浓度(x,ng/L)作线性曲线,得工作曲线:y=1 164.7x-1 201.7,R2=0.999 5。线性曲线的定量准确性用回收率A表示。A=C测试浓度/C标准浓度×100%。C测试浓度为实际测得的TCT质量浓度,计算方法为将线性曲线浓度点峰面积带入工作曲线,计算所得浓度。C标准浓度为配制的对照品溶液的实际浓度。经计算所得,线性曲线的7个浓度点回收率在98.7%到104.8%范围内,表明该方法用于5.76 ng/L到369 ng/L浓度范围内TCT的含量测定具有较高的准确性。

2.4.5重复性

考察了低质量浓度(11.53 ng/L)和中等质量浓度(92.25 ng/L)的TCT对照品溶液进样5次的峰面积重复性,其RSD分别为3.9%和2.7%。TCT为疫苗中需严格控制的有毒物质,如果疫苗中存在TCT,为保证定量准确性,避免疫苗质量的误判,测定其含量所用标准曲线建议每天测试。

2.5 百日咳和百白破疫苗中TCT的含量测定

将优化后的LC-MS/MS方法用于9个不同厂商生产的共纯化百日咳疫苗、组分百日咳疫苗、共纯化百白破疫苗和组分百白破疫苗中TCT的筛查和含量测定。如表2所示,9个疫苗样品中均无TCT检出,表明这些疫苗均未受TCT污染。方法回收率由以下方法[3,17]测试:回收率=(A加标-A样品)/A标×100%,其中A加标为疫苗加标样品进样所得TCT峰面积,A样品为样品进样所得TCT峰面积;A标为对照品溶液进样所得TCT峰面积。回收率测试溶液配制方法如下:(1)标样配制:取质量浓度为184.5 ng/L的TCT溶液100 μL,加入900 μL疫苗空白基质。(2)样品配制:取疫苗样品900 μL,加入100 μL疫苗空白基质。(3)样品加标:取疫苗样品900 μL,加入100 μL质量浓度为184.5 ng/L TCT溶液。如表2所示,TCT在所有样品基质中均具有较好的回收率,表明共纯化百日咳疫苗、组分百日咳疫苗、共纯化百白破疫苗和组分百白破疫苗基质均对TCT检测没有明显抑制作用[18]。

表 2 百日咳和百白破疫苗样品中TCT的检测结果和回收率

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3 结论

本文发展了一种HILIC-MS/MS方法用于共纯化百日咳疫苗、组分百日咳疫苗、共纯化百白破疫苗和组分百白破疫苗中TCT的检测。该方法可实现不同厂家百日咳和百白破疫苗中TCT的高灵敏度快速筛查,其灵敏度比已报道的衍生-HPLC-UV方法高9 781倍,LOQ是药典要求疫苗中TCT最高残留量的1/1 279,完全满足药典对百日咳和百白破疫苗中TCT含量测定的要求。