miR-378a-5p下调人肝脏星形细胞系LX-2中鞘胺醇激酶1的表达

祁长波 常 娜 杨 琳 李丽英

(首都医科大学细胞生物学系‘肝脏保护与再生调节’北京市重点实验室，北京 100069)

在肝纤维化/肝硬化的过程中，肝脏肌成纤维细胞(hepatic myofibroblasts，hMFs)合成大量细胞外基质成分，致使其在肝脏中过量沉积，导致肝纤维化的发生[1]。有文献[2]报道，hMFs具异质性，而肝脏星形细胞(hepatic stellate cells, HSCs)，是其重要来源之一，在肝纤维化的发生、发展过程中至关重要。肝损伤发生时，HSCs活化，转变成hMFs。活化的HSCs导致肝纤维化的发生，因此了解HSCs活化的分子机制对阐明肝纤维化发病机制乃至转归尤为关键。本研究中笔者采用人肝脏星形细胞系(LX-2细胞)来进行相关研究。

Li等[3-6]的前期研究结果已证实鞘胺醇激酶1(sphingosine kinase 1, SphK1)及其产物鞘胺醇-1-磷酸(sphingosine 1-phosphate, S1P)组成的SphK1/S1P系统，能够显著影响LX-2细胞的活化及肝纤维化的发病进程。有文献[7-8]报道，转化生长因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)，在HSCs活化的过程中发挥重要作用。本课题组[9-11]的前期实验也证实，TGF-β1促进SphK1表达并以SphK1依赖的方式诱导细胞向hMFs活化。那么在HSCs活化的过程中，是否还有其他调控因子参与了TGF-β1调控SphK1表达的过程，目前尚不清楚。

转录后调控是近年来基因调控研究的热点，作为重要的转录后调控因子，microRNA(miRNA)对于许多病生理过程均有重要调控作用。文献[12-15]报道，miRNA可以通过调控不同靶基因的表达参与HSCs活化过程，并促进或抑制肝纤维化发病的进程。研究[16-19]显示，miR-125b、miR-101、miR-506以及miR-124可在多种肿瘤发生的过程中调控SphK1表达。同时，TGF-β1也可以通过miRNA调控下游基因的表达[20-21]。例如在肾纤维化中，TGF-β1上调了细胞内miR-21水平，且这一过程与SphK1/S1P系统密切相关[22]。那么miRNA是否参与了TGF-β1诱导的SphK1表达调控过程，进而影响HSCs活化呢？为了探究这一问题，本研究通过生物信息学数据库miRWalk (http://129.206.7.150/)和Targetscan (http://www.targetscan.org/vert_71/)预测可能靶向SphK1 mRNA的miRNAs，取交集后在小鼠肝脏组织中检测各miRNA的表达，筛选出miR-378a-5p作为研究对象，并在LX-2细胞中探究其是否能够调控SphK1 mRNA的表达。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

DMEM培养基(Gibico公司，美国)；胎牛血清(Excell公司，中国)；青/链霉素、胰蛋白酶(Gibico公司，美国)；TGF-β1(PeproTech公司，美国)；M-MLV反转录试剂盒(Invitrogen公司，美国)；TRIzol试剂及相分离管体系(TRIzol Reagent and Phasemaker Tubes Complete System)(Invitrogen公司，美国)；RNA提取纯化试剂盒(Gene JET RNA Purification Kit)(Invitrogen公司，美国)；microRNA模拟物及抑制剂(micrONTM miRNA mimic/micrOFFTM miRNA inhibitor)(广州市锐博生物科技有限公司，中国)；miRNA实时荧光定量核酸扩增检测试剂盒(Bulge-LoopTM miRNA qRT-PCR Kit)(广州市锐博生物科技有限公司，中国)；SYBR Green聚合酶链式反应混合试剂(SYBR Green PCR Master Mix)(ABI公司，美国)；脂质体转染试剂(Lipofectamine RNAiMAX)(Invitrogen公司，美国)。

CO2细胞培养箱BB16(Heraeus公司，德国)；实时荧光定量PCR仪ABPrism 7300(ABI公司，美国)。

1.2 动物模型

采用4周龄ICR小鼠进行造模，共12只小鼠，对照组、实验组每组各6只。查正态曲线下面积表得出把握度>0.90，符合实验设计要求。采用数字表法将小鼠随机分为对照组和造模组。模型组：橄榄油按照体积比1∶9稀释四氧化碳(carbon tetrachloride, CCl4)，腹腔注射(10 mL/kg)，每周注射2次。对照组：腹腔注射相应体积的橄榄油(olive oil, OO)。处死小鼠当天注射最后1次。饲养4周完成模型制作，后处死小鼠获取肝脏样本，处死前禁食6 h，常规饮水。

1.3 细胞培养

LX-2细胞采用含10%(体积分数)胎牛血清、1%(质量分数)青/链霉素的DMEM培养基，置于37 ℃、5%(体积分数)CO2细胞培养箱中进行培养。接种密度为1×106/大皿(r=10 cm)或7×105/中皿(r=6 cm)。当细胞汇合度达到90%时进行传代，取处于对数生长期的细胞进行实验。

1.4 MicroRNA模拟物及抑制剂的转染

转染前1 d接种4×105个细胞于6 cm细胞培养皿，当细胞汇合度到达50%～60%时进行转染；转染步骤参照脂质体转染试剂(Lipofectamine RNAiMAX)说明书。MicroRNA模拟物转染终浓度为50 nmol/L，microRNA抑制剂转染终浓度为100 nmol/L。6～8 h后换为完全培养基。成熟miRNAs的序列见表1。

1.5 细胞总RNA提取

弃旧培养基，每中皿加500 μL TRIzol 试剂，混匀收集细胞样品至分离管，静止5 min；加0.2 mL氯仿，用力摇晃15 s，25 ℃静置2～3 min；4 ℃ 12 000 g离心15 min，将最上层水相转移至新的EP管；加0.5 mL的100%(体积分数)异丙醇，倒置轻轻混匀，25 ℃静置10 min；4 ℃ 12 000 g离心10 min，弃上清；加 1 mL的75%(体积分数)乙醇，短暂漩涡，4 ℃ 7 500 g离心5 min，弃上清；无RNA酶洁净空气干燥5～10 min，加50 μL的无RNA酶水溶解，55～60 ℃孵育10 min。检测定量进行后续反转录。

1.6 实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)

采用RNA提取纯化试剂盒(Gene JET RNA Purification Kit)提取细胞RNA。检测定量后取1 μg RNA进行反转录(不加反转录酶作为阴性对照，即No-RT)。采用反转录后的cDNA原液进行相应倍数的稀释，进行qPCR。该过程中使用的引物序列见表2。检测的临界点设定在PCR扩增过程中，荧光信号由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环数(Ct)作为模板初始浓度的间接指标，熔解曲线分析采用默认条件。结果以18S rRNA进行校正，用ΔΔCt法计算相对基因表达量。

PCR: polymerase chain reaction;SphK1:sphingosine kinase 1；TNF-α: tumor necrosis factor-α.

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 预测可能调控SphK1 mRNA表达的microRNA

采用生物信息学数据库TargetScan和miRWalk对可能调控SphK1的microRNA进行预测。由TargetScan Human获得143个miRNA，miRWalk获得387个miRNA，两者结果取交集，获得34个miRNA(图1)。由于后续工作中将在造模小鼠肝脏组织中检测miRNA的表达情况，故在这些miRNA中选取人鼠同源的miRNA，结果为miR-378a-5p、miR-92a-2-5p和miR-708-5p。

2.2 参与肝脏纤维化microRNA的筛选

在造模小鼠肝脏组织样本中检测以上3种miRNA的表达状况。与对照组miR-378a-5p的表达相比，CCl4组miR-378a-5p的表达下调至0.56倍(P<0.05)；与对照组miR-92a-2-5p的表达相比，CCl4组miR-378a-5p的表达下调至0.98倍(P<0.05)；与对照组miR-708-5p的表达相比，CCl4组miR-708-5p的表达上调至9.82倍(P<0.05)(图2A)。

同时，在造模小鼠肝脏组织样本中检测炎性反应及纤维化相关的指标。与对照组相比，CCl4组小鼠肝脏中TNF-α mRNA的表达上调至6.30倍(P<0.05)(图2B)，Col α1(Ⅲ) mRNA的表达上调至3.96倍(P<0.05)(图2C)。此外，miR-378a-5p的表达与Col α1(Ⅲ)的表达呈负相关，相关系数为-0.751(P<0.01)(图2D)。根据miRNA负调控靶基因的先决条件,以及miR-378a-5p与Col α1(Ⅲ)的表达呈负相关，选取其作为后续研究对象，miR-92a-2-5p作为阴性对照。

图1 生物信息学预测可能调控SphK1 mRNA的microRNAFig.1 Predict results for microRNA that may regulate SphK1 mRNA

2.3 miR-378a-5p和miR-92a-2-5p与SphK1 mRNA预测的结合位点

作为重要的转录后调控因子，成熟的microRNA可以招募Ago蛋白，形成RISC复合体，通过与靶基因mRNA的3’UTR区域结合，抑制其翻译或降解其mRNA，从而调控该基因的表达。由TargetScan数据库得到，miR-378a-5p和miR-92a-2-5p与SphK1 mRNA 3’UTR的预测结合关系如图3所示。

2.4 miR-378a-5p抑制LX-2中TGF-β介导的SphK1 mRNA表达上调

为了研究miR-378a-5p是否影响SphK1 mRNA的表达，对LX-2进行microRNA模拟物转染的实验。在转染后第24小时换无血清培养基，加入TGF-β1(终浓度10 mg/L)，刺激24h后收集细胞，提取RNA进行反转录，后通过RT-qPCR检测SphK1 mRNA的表达。结果表明，TGF-β1能够明显上调LX-2中SphK1 mRNA的表达，使其上调至3.99倍(P<0.05)。miR-378a-5p可以抑制这一过程(图4)。

图2 miR-378a-5p参与CCl4诱导的肝脏纤维化Fig.2 miR-378a-5p participated in CCl4-induced liver fibrosis

A：Relative miRNA expression was examined in the liver tissues of CCl4-treated mouses. miR-378a-5p, miR-92a-2-5p and miR-708-5p were detected, respectively;B：expression of TNF-α mRNA in the CCl4-treated mouse liver;C：expression of Colα1(Ⅲ) mRNA in the CCl4-treated mouse liver;D：correlation between miR-378a-5p expression and SphK1 mRNA expression;*P<0.05.CCl4：carbon tetrachloride；TNF-α：tumour necrosis factor-α；OO: olive oil;SphK1:sphingosine kinase 1.

图3 miR-378a-5p/miR-92a-2-5p与SphK1 mRNA 3’UTR的预测结合位点Fig.3 Predicted binding sites between miR-378a-5p/miR-92a-2-5p and SphK1 mRNA 3’UTR

2.5 miR-378a-5p作用被抑制剂阻断后LX-2中SphK1 mRNA表达上调

为了进一步研究miR-378a-5p调控SphK1 mRNA的表达，对LX-2进行miR-378a-5p抑制剂转染的实验。在转染后第48小时收集细胞，提取RNA进行反转录，后通过RT-qPCR检测SphK1 mRNA的表达。结果表明，采用miR-378a-5p抑制剂抑制miR-378a-5p的作用后，SphK1 mRNA的表达显著上调，至对照组的2.16倍(P<0.05)(图5)。

图4 miR-378a-5p能够抑制LX-2中由TGF-β1引起的SphK1 mRNA表达上调Fig.4 miR-378a-5p suppress the increase of SphK1 mRNA expression caused by TGF-β1 in LX-2

*P<0.05vsmimic Ctrl vehicle group，#P<0.05vsmimic Ctrl TGF-β1 group;SphK1:sphingosine kinase 1；TGF-β1:transforming growth factor-β1；Ctrl:control.

图5 阻断miR-378a-5p作用后SphK1 mRNA表达上调Fig.5 Increase of SphK1 mRNA expression caused by inhibition of miR-378a-5p in LX-2

*P<0.05;SphK1:sphingosine kinase 1.

3 讨论

鞘胺醇激酶(sphingosine kinase, SphK)包括两种亚型，SphK1和SphK2，均能催化鞘胺醇的磷酸化，产生脂质分子 S1P。近几年来，研究[23-25]结果表明SphK1参与了肝脏、心脏、肺脏等多种纤维化疾病的过程，并在其中发挥重要的作用。文献[24]报道，TGF-β-SphK1 /S1P信号通路能够促进肾小管上皮细胞的纤维化。也有研究[25]显示，靶向SphK1可以缓解博来霉素诱导的肺纤维化。通过以上证例可见详尽探究SphK1参与纤维化过程分子机制的重要性，且相关研究可为纤维化疾病的治疗提供新的思路。

有文献[26]报道，SphK1能够被多种因子激活，包括表皮生长因子、血管内皮生长因子、血小板衍生生长因子、激素及TGF-β1。TGF-β1是重要的促纤维化细胞因子之一，在HSCs的活化和肝纤维化过程中发挥重要作用。研究[27-31]显示，在肺脏、心脏及胚胎的成纤维细胞中，TGF-β1能够增强SphK1 mRNA及蛋白的表达，促进纤维化的发生。本实验室[9-11]前期结果也证实，TGF-β1诱导hMSCs及hHSCs分化为集成纤维细胞，并且上调hMSCs及hHSCs中SphK1的表达和活性。

近年来miRNA因参与转录后调控而备受关注，作为重要的转录后调控因子，miRNA与多种疾病的发生、发展紧密相关，也为疾病的筛查和治疗提供新的策略。miRNA是由内源基因编码的、长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子。在细胞内，miRNA与Dicer酶，AGO蛋白等生物大分子形成RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complex, RISC)并结合于靶标mRNA的3’-非翻译区(3’-untranslated regions, 3’-UTR)，主要通过促进mRNA降解、抑制翻译的方式抑制靶基因表达[12]。

miR-378a为miR-378家族的一员，在CCl4肝纤维化模型中，miR-378a与另两个家族成员miR-378b、miR-378d表达下降；且当miR-378a过表达时，HSCs活化被抑制，肝纤维化程度减轻[32]。此外，miR-378还可以对心肌纤维化过程进行负调控[33]。而miR-92a则可以在肺纤维化过程中抑制TGF-β1诱导的WNT1诱导型信号通路蛋白1(WISP1)表达[34-35]。

本研究结果显示，miR-378a-5p、miR-92a-2-5p和miR-708-5p与SphK1 mRNA 3’-UTR存在结合位点(生物信息学数据库预测)。在造模小鼠肝脏组织样本中，miR-378a-5p的表达明显下调，miR-92a-2-5p的表达略微下调，miR-708-5p的表达显著上调，根据miRNA负调控靶基因的先决条件，选取miR-378a-5p在LX-2细胞中进一步进行验证。结果表明，miR-378a-5p能在LX-2细胞中调控SphK1 mRNA的表达。生物信息学数据库预测的结果，仍需要细胞实验的进一步验证。