TMPRSS2-ERG融合基因在淋巴结转移前列腺癌中的阳性率及与生存的关系

谢英伟 金世鹏 闫 伟 王 伟 平 浩 刘跃新

(首都医科大学附属北京同仁医院泌尿外科，北京 100730)

前列腺癌(prostate cancer，PCa)是男性中常见的恶性肿瘤。我国前列腺癌发病率远低于欧美国家，但近年来呈上升趋势，且增长比欧美发达国家更为迅速，目前已成为泌尿系统中发病率最高的肿瘤[1-2]。基因融合是指基因在染色体上发生位置错位、 融合的现象，从而产生新的融合基因，该基因可能具有新的功能。TMPRSS2-ERG(T-E)基因融合是前列腺癌中已知最常见的遗传改变。TMPRSS2-ERG融合和随后ERG蛋白的过表达已被证明与Wnt相关雌激素受体信号通路的上调以及肿瘤坏死因子和细胞死亡通路的下调有关[3]。然而TMPRSS2-ERG在肿瘤发生、发展中的生物学作用尚不清楚。目前研究者对该基因融合的各个方面进行了广泛的探索，但一些基本知识仍然还不完整。特别是在伴有淋巴结转移的前列腺癌组织中TMPRSS2-ERG融合基因的发生率以及对预后的影响。本研究利用FISH检测50例伴有淋巴结转移前列腺癌标本中的TMPRSS2-ERG融合基因，并对其与前列腺癌临床病理资料及治疗预后的关系进行了分析。

1 对象与方法

1.1 研究对象

本研究以2008年1月至2012年12月于首都医科大学附属北京同仁医院行根治性前列腺癌切除术+扩大盆腔淋巴结切除术的患者为研究对象。所有患者术前检查包括盆腔电子计算机断层扫描(computed tomography， CT)、磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)及骨扫描未发现有转移证据，术后病理提示切除标本有淋巴结转移。排除标准：(1)术前接受新辅助治疗；(2)术后未行内分泌治疗。所有手术切除前列腺以及淋巴结标本由首都医科大学附属北京同仁医院泌尿外科病理科两位资深医师独立阅片，同时按照2002年美国癌症联合委员会(The American Joint Committee on Cancer，AJCC)的 TNM分期系统进行临床分期。

根治性前列腺切除术+扩大淋巴结清扫术：手术切除范围包括完整的前列腺、双侧精囊和双侧输尿管壶腹段、膀胱颈部。淋巴结切除范围包括髂外、髂内、闭孔、髂总与输尿管交叉处。

随访：要求患者治疗后的前 6个月中每个月复查1次前列腺特异性抗原(prostate specific antigen，PSA)，此后每3个月进行PSA等相关检查。随访终点为病情进展成去势抵抗性前列腺癌(castration resistant prostate cancer, CRPC)：①血清睾酮达到去势水平(<5 ng/mL)；②连续3 次PSA较最低值升高超过50%，且PSA值>0.2 ng/mL。

1.2 实验材料

标本为前列腺癌根治术后前列腺及淋巴结组织石蜡包埋切片以及前列腺增生组织石蜡包埋切片、 二甲苯、去离子水、蛋白酶K、2×SSC(2×柠檬酸钠缓冲液)、70%(体积分数)乙醇、85%(体积分数)乙醇、100%(体积分数)乙醇、0.1% (质量分数)NP-40/2×SSC、20 μL DAPI(4,6-联脒-2-苯基吲哚二盐酸盐)、TMPRSS2：ERG(北京金菩嘉医疗科技有限公司)。

1.3 实验步骤

1.3.1 切片预处理

将组织切片(厚度为3 μm)置于56 ℃下烤片过夜；室温下将组织切片浸于二甲苯中脱蜡2次，每次10 min，随后浸入100%(体积分数)乙醇中5 min。室温下将组织切片依次置于100%(体积分数)乙醇、85%(体积分数)乙醇和70%(体积分数)乙醇中各2 min复水。将组织切片室温浸入去离子水中3 min，然后95 ℃下用水处理组织切片20 min。取40 mg胃蛋白酶溶于40 mL 0.01 mol/L HCL得到胃蛋白酶工作液(1 mg /mL)；将组织切片浸泡在蛋白酶K工作液中，37 ℃下孵育8 min左右；组织切片经蛋白酶K消化后，于2×SSC溶液中漂洗5 min。室温下将组织切片玻片依次置于70%(体积分数)乙醇、85%(体积分数)乙醇和100%(体积分数)乙醇中各2 min脱水；自然干燥玻片后，进行以下杂交变性。

1.3.2 变性杂交

将配制好的10 μL杂交探针缓冲液(2 μL探针和8 μL缓冲液)离心1～3 s，涡旋混匀后再次短暂离心；将10 μL 探针混合物滴加于玻片杂交区域，立即加盖盖玻片，用橡皮胶封边；准备水浴锅、铁板，共变性条件：86 ℃，10 min，然后放入湿盒杂交，杂交条件：42 ℃，16 h(注意保持湿盒里的湿度)。

1.3.3 玻片洗涤及复染

移去盖玻片，将玻片置于46 ℃，0.1%(质量分数)NP-40/0.4×SSC溶液中，振荡1～3 s，漂洗5 min；室温下将玻片置于70%(体积分数)乙醇中，漂洗3 min。暗处自然干燥玻片后，将20 μL DAPI复染剂滴加于杂交区域位置，立即盖上盖玻片。暗处放置10～20 min后，在荧光显微镜下选用合适的滤光片组观察玻片，完成杂交的玻片置于-20 ℃避光储存。为了长期保存还可以用中性树胶将加盖的盖玻片四周密封，防止反复观察移动盖片。

1.4 FISH结果判读

1.4.1 FISH技术对基因融合的检测

TMPRSS2/ERG：正常时为两个融合信号，即2个黄色信号；出现1个融合信号(即黄色)；1个绿信号时，提示ERG基因发生融合；1个融合信号，1个红信号，1个绿信号，提示有ERG基因与其他基因的融合或重组。

1.4.2 建立阈值

随机取前列腺增生病理石蜡标本10例，制备玻片及进行FISH实验。每份样本随机分析100个细胞，计算出显示异常信号细胞数百分比的平均值及标准差，异常阈值定义为平均值+3倍标准差，即异常阈值=平均值(M)+3×标准差(SD)。每例样本随机计数100个细胞，用异常阈值判断检测结果。检测结果中显示，异常信号细胞的计数的百分比大于阈值3.9%即为异常(例如：6%)，则判断该患者存在融合基因，判定为阳性结果。检测结果中显示异常信号细胞计数的百分比小于阈值3.9%即正常(例如：3%)，则判断该患者无融合基因的存在，判定为阴性结果。如果显示异常信号方式细胞数的百分比等于阈值，加大检测样本的细胞数目，以判断最后结果。利用FISH技术，对前列腺癌切片进行TMPRSS2/ERG基因融合状况进行检测，计算异常信号的百分比。

1.5 统计学方法

应用SPSS 20.0软件对数据进行统计分析。使用Cohen的kappa统计量(k)评估原发肿瘤与转移灶TMPRSS2-ERG融合基因之间的一致性。组间比较计量资料采用t检验，计数资料采用χ2检验。采用COX回归分析影响患者生化复发的因素。患者疾病生化无复发生存期比较采用 Kaplan-Meier法。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

本研究共纳入50例患者，手术组的中位年龄为76(65～88)岁。原发肿瘤临床分期pT2 6例， pT3a 23例， pT3b 21例。Gleason评分6分10例、7分26例、8分7例、9分7例。共切除淋巴结1 236枚，每例切除淋巴结19～32枚，平均22枚。共转移淋巴结1 236枚，每例转移淋巴结1～9枚，平均3枚。平均随访(30±12)个月，生化复发45例，死亡8例，前列腺癌特异性死亡4例。

在50例样本中，19例(38%)在原发肿瘤中检测到TMPRSS2-ERG融合基因，15例(32%)在淋巴结中检测到TMPRSS2-ERG融合基因。一致性分析显示，TMPRSS2-ERG融合基因在原发肿瘤及匹配淋巴结标本中具有较高的一致性，Kappa=0.73(P<0.05)。10%的患者融合基因仅出现在原发肿瘤，2%的患者融合基因仅出现在转移灶。详见表1。

原发性肿瘤和相应淋巴结转移中的TMPRSS2-ERG融合基因阳性与阴性组之间肿瘤特征差异无统计学意义，详见表2。

表2 TMPRSS2-ERG(T-E)融合基因阳性与阴性组之间的肿瘤特征Tab.2 Tumor characteristics between positive and negative groups of TMPRSS2-ERG fusion gene

单因素COX回归分析显示，患者无生化复发生存期与Gleason评分、分期、清扫淋巴结数、转移淋巴结数、原发肿瘤融合基因阳性、淋巴结融合基因阳性有关，详见表3。多因素COX回归分析显示，患者无生化复发生存期与Gleason评分、原发肿瘤融合基因阳性有关，详见表4。

单因素生存分析显示，原发肿瘤中TMPRSS2-ERG融合基因阳性组比阴性组预后差，无生化复发生存率差异存在统计学意义(P=0.01；图1)。原发肿瘤/淋巴结TMPRSS2-ERG融合基因(+/+)组与原发肿瘤/淋巴结融合基因(+/-)组预后低于原发肿瘤/淋巴结融合基因(-/-)组，无生化复发率差异存在统计学意义(P=0.03)。原发肿瘤/淋巴结TMPRSS2-ERG融合基因(+/+)组与原发肿瘤/淋巴结融合基因(+/-)组之间无生化复发生存率差异无统计学意义(P=0.17；图2)。

表4 多因素COX回归分析患者无生化复发生存期影响因素Tab.4 Multivariate COX regression analysis of factors influencing patients without biochemical recurrence

图1 原发肿瘤中TMPRSS2-ERG融合基因阳性组与阴性组无生化复发生存期Fig.1 Biochemical recurrence-free survival of the patients in the TMPRSS2-ERG fusion gene positive and negative groups with primary tumors

3 讨论

TMPRSS2-ERG融合基因是前列腺癌中最常见的已知遗传改变。自2005年Tomlins等[4]首次报道前列腺癌的跨膜丝氨酸蛋白酶编码基因TMPRSS2-ERG与ETS转录因子家族成员ERG、ETV1等之间发生融合后，国内外对融合基因及其蛋白表达在前列腺癌发病机制、检测、诊断及预后判断等方面做出了广泛的研究。

TMPRSS2-ERG融合基因的发生率在不同人种之间存在明显差异。欧美几个研究中心样本量超过500例的研究显示，TMPRSS2-ERG融合基因发生率约为50%[5]。Furusato 等[6]利用ERG蛋白免疫组织化学法检测230例日本前列腺癌标本(包括穿刺和根治标本)显示阳性率为20.1%，Suh等[7]同样利用ERG免疫组化检测303例前列腺癌标本显示阳性率为24.4%。在中国人前列腺癌组织中，TMPRSS2-ERG融合基因检出率分别为19.8%、23.2%、14.3%[8-10]。不同研究中心的检测结果存在一定差异，这可能与研究的人种、标本类型、样本量大小、检测方法等的不同相关。研究TMPRSS2-ERG融合基因在原发肿瘤及其转移灶中的流行情况可能有助于进一步阐明该突变的生物学作用。目前关于TMPRSS2-ERG融合基因与PCa侵袭性的关系仍无定论[11-12]，但 Attard等[13]却发现多数病情进展迅速的PCa患者存在TMPRSS2-ERG融合基因 mRNA大量复制，Gopalan等[14]的研究不仅证实了这一现象，而且还发现复制不是TMPRSS2-ERG融合基因的特异性扩增，而是染色体拷贝数的增加，从而导致遗传学不稳定性，进而促进PCa的侵袭进展。 另有研究[15-16]显示，在多病灶的原发性PCa患者中，TMPRSS2-ERG融合基因阳性者外周转移率较阴性者高；不同病灶位点各自克隆增生，并向外周转移。在Perner等[17]的研究中，26例原发性前列腺癌与其淋巴结转移之间的TMPRSS2-ERG融合基因状态完全一致，他们认为TMPRSS2-ERG融合基因阳性的病灶更容易出现淋巴结的转移。刘彼得等[18]研究发现前列腺癌患者T-E融合基因的总阳性率为 40.0%， 其中转移性 PCa 组、局限性 PCa 组及良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia,BPH)组分别为 45.0%、 30.0%、 0.0%。本研究选取的标本为前列腺癌根治术后伴淋巴结转移的标本，原发肿瘤中TMPRSS2-ERG融合基因阳性率为38%。外周淋巴结转移灶中TMPRSS2-ERG融合基因阳性率为30%。其中原发肿瘤与淋巴结转移灶中TMPRSS2-ERG融合基因一致性较好(Kappa为0.73)。这表明这种突变可能是特征性侵袭性肿瘤的特征。

图2 原发肿瘤/淋巴结TMPRSS2-ERG融合基因(+/+)组、原发肿瘤/淋巴结融合基因(+/-)组与原发肿瘤/淋巴结融合基因(-/-)组无生化复发生存期Fig.2 Biochemical recurrence-free survival of primary tumors/lymph nodes TMPRSS2-ERG fusion gene (+/+) group, primary tumors/lymph nodes fusion gene (+/-) group and primary tumors/lymph nodes fusion gene (-/-) group

关于TMPRSS2-ERG融合基因在前列腺癌根治术中患者预后相关性的研究存在一定争议。根据生存曲线，TMPRSS2-ERG融合基因是一个不好的[19]，好的[20]或无相关性的[14]预后因素。多项研究[21-26]显示ERG蛋白表达与PCa的生化复发之间的关系是一致的。Hagen等[23]研究结果显示，28例ERG水平高的患者中有13例(46.4%)复发，而25例ERG水平低的患者中只有3例(12%)复发(P=0.006)。Font-Tello等[24]观察到在25例ERG阴性患者中有3例(12%)PSA进展，38例ERG阳性患者中有13例(34.2%)PSA进展(P=0.04)。但这些研究没有特别关注患者的淋巴结状态，以及分析TMPRSS2-ERG融合基因在淋巴结转移患者的预后中的作用。笔者的研究队列非常适合评估这个未解决的问题。本研究纳入的患者全部接受了根治性前列腺癌切除术+扩大盆腔淋巴结切除术，术后接受内分泌治疗。在随访过程中，90%的患者出现了生化复发。笔者在多因素分析中发现，原发肿瘤中TMPRSS2-ERG融合基因是患者生化复发的不良独立预测因素。同时笔者在单因素生存分析中发现，原发肿瘤中TMPRSS2-ERG融合基因阳性组比阴性组预后差(P=0.01)。进一步分析发现，原发肿瘤/淋巴结TMPRSS2-ERG融合基因(+/+)组预后低于原发肿瘤/淋巴结融合基因(-/-)组，无生化复发率差异存在统计学意义(P=0.03)。但原发肿瘤/淋巴结融合基因TMPRSS2-ERG(+/+)组与原发肿瘤/淋巴结融合基因(+/-)组之间无生化复发生存率差异无统计学意义(P=0.17)。笔者认为未来需要纳入更多的病例以及延长随访时间来进一步分析。

综上，本研究显示TMPRSS2-ERG融合基因在淋巴结转移前列腺癌中的阳性率为38%。原肿瘤与淋巴结转移灶中TMPRSS2-ERG融合基因具有较好的一致性(Kappa=0.73)。TMPRSS2-ERG融合基因是转移性前列腺癌生化复发的不良预后因素。