单羧酸转运蛋白4(MCT4)在前列腺癌中的表达及调控研究

平 浩 马林祥 王明帅 龙 军 牛亦农 刘跃新 邢念增

(1.首都医科大学附属北京同仁医院泌尿外科，北京 100730; 2.首都医科大学附属北京朝阳医院泌尿外科，北京 100020; 3.首都医科大学基础医学院免疫学系，北京 100069; 4.国家癌症中心 国家肿瘤临床医学研究中心 中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院，北京 100021)

前列腺癌(prostate cancer，PCa)是欧美国家发病率第一位的男性恶性肿瘤，病死率仅次于肺癌。我国近年来前列腺癌发病率和病死率呈逐渐升高趋势，尤其是如果不能早期发现易发生远处转移，包括骨转移和肺转移等，严重威胁着老年患者生命健康[1]。目前研究[2]显示，单羧酸转运蛋白4(monocarboxylate transporters 4, MCT4)作为单羧酸转运蛋白家族的重要成员，不仅可以参与肿瘤的新陈代谢，还可能诱导和促进肿瘤的恶性生物学行为，可作为肿瘤新的生物学指标和治疗靶点[3]。MCT4可将肿瘤细胞产生的大量乳酸转运到细胞外，并维持内环境及pH值的稳定，促进肿瘤细胞迁移和侵袭，并为肿瘤细胞的有氧代谢提供原料[4]。近年来研究[5]证实，MCT4在多种肿瘤中呈现高表达状态，且与肿瘤的增生、侵袭及预后密切相关。但MCT4在中国人群前列腺癌中的表达和调控机制，目前尚不完全清楚。

本研究着重观察MCT4蛋白在前列腺癌组织和细胞中的表达情况，探讨其与前列腺癌恶性程度和转移的关系，同时研究MCT4在前列腺癌细胞中的调控机制，明确其在前列腺癌发展和转移中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

收集2012至2018年首都医科大学附属北京朝阳医院部分手术标本及病理科存档标本，其中PCa 56例，前列腺增生(benign prostatic hyperplasia，BPH)30例，癌旁组织(para-carcinoma tissues，PCT)20例，患者平均年龄为(62.4±7.9)岁。标本来自前列腺根治性切除术、前列腺摘除术及前列腺电切术患者，均经病理科医师病理诊断证实。依照Gleason评分标准， Gleason≤7者38例， Gleason>7者18例。前列腺癌淋巴结转移阳性患者12例，无转移患者44例。本研究通过医院伦理委员会批准(批准文号：2013-X-83)。免疫组织化学及免疫印迹(Western blotting)所用抗体为MCT4、E-Cadherin、N-Cadherin及p-ERK1/2单克隆抗体，购自美国BD、Santa Cruz及Cell Signaling公司。慢病毒载体系统LVpFU-GW-RNAi购自上海吉凯基因有限公司。

1.2 检测方法

1.2.1 免疫组织化学检测MCT4在前列腺癌组织中的表达

采用免疫组织化学SP法，按照试剂盒说明书逐步操作，在组织切片中加入一抗(兔抗人MCT4单克隆抗体)和二抗后，联苯二胺(diaminobenzidine,DAB)显色，阴性对照以磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline,PBS)代替一抗。结果判定：MCT4蛋白表达表现为阳性着色主要位于细胞质，颜色呈淡黄色、棕黄色或棕褐色着色。阳性表达根据着色程度和阳性细胞百分比综合作半定量分析。①按显色强度评分：细胞无显色为0分；浅黄色为1分；棕黄色为2分；棕褐色为3分。②按阳性细胞百分率评分：200倍视野下计数，无阳性细胞为0分；阳性细胞率<10%为1分；10%～50%为2分；51%～80%为3分；>80%为4分。上述两项评分相乘为0分视为表达阴性，1～5分为低表达，6～12分为高表达[6]。

1.2.2 细胞培养及转染

正常前列腺上皮细胞系RWPE-1(中科院上海细胞库)培养于培养基K-SFM中，人前列腺癌细胞系LNCap、PC3、DU145分别培养于含10%(体积分数)胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的RPMI1640及DMEM培养基中，所有细胞均在饱和湿度、37 ℃、5%(体积分数)CO2条件下培养。将PC-3细胞接种于24孔培养板，接种浓度5×104/孔，细胞融合达到40%时，干扰组(shRNA-MCT4)加pFU-GFP-MCT4-RNAi慢病毒颗粒。设阴性对照组(shRNA-NC)，加对照病毒。6 h后观察无细胞毒性，24 h后更换培养液，以后常规换液传代。72 h后荧光倒置显微镜观察转染效率，转染效率>80%的细胞培养一周后用于提取蛋白。

1.2.3 蛋白提取及Western blotting检测

收集细胞后，提取总蛋白，分别取50 μg上样， 12%(质量分数)SDS-PAGE分离蛋白，120 V恒压电泳1 h。分离后的蛋白电转移至硝酸纤维素膜上，用含5%(质量分数)脱脂奶粉的TBST对膜封闭30 min，分别加入一抗(稀释比例均为1∶500)，4 ℃孵育过夜。次日用TBST缓冲液冲洗漂洗后，再加入HRP标记的相应IgG二抗(稀释比例为1∶2 000)，在室温条件下反应1 h，TBST洗膜。其中以Actin作为内对照。最后采用ECL发光法显色，X线进行胶片曝光，采集图像。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析。计数资料用频数和百分数表示，采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 前列腺癌、前列腺增生及癌旁组织中MCT4蛋白的表达

免疫组织化学染色显示，MCT4蛋白表达主要位于间质细胞和肿瘤细胞的胞膜和胞质中。56例前列腺癌组织中，MCT4蛋白表达阳性者有48例，阳性表达率为85.7%；而癌旁组织中12例呈阳性，阳性表达率为60%(12/20)；良性前列腺增生组织中16例呈阳性，阳性表达率为53.3%(16/30)，差异有统计学意义(P=0.003)。详见表1及图1。

表1 MCT4蛋白在前列腺癌、前列腺增生及癌旁组织中的表达Tab.1 Expression of MCT4 in PCa, PCT and BPH

MCT4:monocarboxylate transporters 4;PCa:prostate cancer;PCT:para-carcinoma tissues;BPH:benign prostatic hyperplasia.

图1 免疫组织化学法检测MCT4蛋白在组织中的表达情况Fig.1 Expression of MCT4 protein was detected with immunohistochemistry

A:BPH(400×);B:PCT(400×);C:PCa (200×);D:PCa(400×);MCT4:monocarboxylate transporters 4;BPH:benign prostatic hyperplasia;PCT:para-carcinoma tissues;PCa:prostate cancer.

2.2 MCT4蛋白在前列腺癌细胞中的表达

Western blotting检测结果显示，在前列腺正常上皮细胞RWPE-1及激素依赖性前列腺癌细胞LNCap中MCT4表达较弱，而在恶性程度较高的去势抵抗性前列腺癌(castration resistant prostate cancer, CRPC)细胞PC3及DU145中表达明显增强，说明MCT4可能与细胞的恶性程度明显相关(图2)。

2.3 MCT4蛋白表达与前列腺癌临床特征之间的关系

MCT4蛋白表达与前列腺癌是否有淋巴结转移密切相关，12例淋巴结转移患者均有阳性表达，转移组显著高于非转移组，两组之间差异有统计学意义(P=0.022)。而通过分析MCT4蛋白表达与前列腺癌临床病理因素的关系显示，MCT4表达水平在不同前列腺癌的病理分级之间差异无统计学意义(P=0.122)，详见表2。

图2 Western blotting检测MCT4在前列腺癌细胞中的表达情况Fig.2 Expression of MCT4 in prostate cancer cells was examined with Western blotting

MCT4:monocarboxylate transporters 4.

2.4 MCT4在前列腺癌中的调控

荧光显微镜下观察病毒转染情况，转染效率>80%(图3)。Western blotting检测抑制MCT4表达后，对N-cadherin、E-cadherin及pERK1/2的影响。结果显示，与阴性对照组(shRNA-NC)相比，RNA干扰组(shRNA-MCT4)不仅明显降低了MCT4蛋白水平，而且使N-cadherin及pERK1/2的蛋白表达下降，同时使E-cadherin蛋白表达水平升高，说明MCT4不但在前列腺癌的上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)中可能发挥重要作用，还可能参与ERK信号通路，从而调节细胞代谢和功能(图4)。

表2 PCa中MCT4蛋白表达与临床病理因素的关系Tab.2 Relationship between MCT4 expression and the clinicopathological features of PCa

图3 荧光显微镜检测病毒转染效率Fig.3 Transfection efficiency observed with fluorescence microscopy(100×)A: light microscopy;B: fluorescence microscopy.

3 讨论

目前，早期发现并手术切除仍然是治愈前列腺癌较为有效的方法，但很多患者就诊时往往已属于中晚期，手术效果不理想或失去了手术根治的机会，目前雄激素剥夺治疗(androgen deprivation therapy, ADT)是晚期前列腺癌的最重要治疗手段[7]。然而，不幸的是，多数前列腺癌患者经过18～24 个月的内分泌治疗后，会变得对ADT 不敏感，从而转变为雄激素非依赖性前列腺癌(androgen-independent prostate cancer, AIPC)或CRPC，最终进展或发生远处转移，是前列腺癌患者肿瘤特异性死亡的重要原因[8]。因此，亟待找到新的或更好的肿瘤标志物或靶点，才可能解决晚期前列腺癌的治疗问题。近年来发现，多数肿瘤细胞生长于相对缺氧的环境中，糖酵解是肿瘤细胞获取能量的主要方式，是构建新血管的最重要的能量来源[9]。而糖酵解产生大量乳酸、丙酮酸等酸性产物，造成细胞内酸化，并反馈性抑制糖酵解反应，从而抑制肿瘤细胞的生长和增生。单羧酸转运蛋白家族则主要通过介导乳酸的跨膜转运实现对糖酵解的调控，该蛋白家族共有14个亚型，在多数正常细胞和组织中的乳酸转出主要是MCT1负责，但在一些细胞中，如肿瘤细胞和内皮细胞，其乳酸的转出主要由MCT4介导，因此，MCT4在肿瘤发展中起到重要的调控作用[10]。研究[11-12]表明，MCT4在多种肿瘤组织中高表达，包括肝癌、肺癌、前列腺癌、肾癌及宫颈癌等肿瘤，参与肿瘤增生、侵袭及转移，且与肿瘤患者的生存期呈负相关，预后不良。

图4 MCT4抑制后对N-cadherin、E-cadherin及 pERK1/2蛋白的调控作用Fig.4 Expression of N-cadherin, E-cadherin and pERK1/2 after inhibition of MCT4 in PC3 cells

MCT4:monocarboxylate transporters 4；NC:normal control.

本研究免疫组化结果显示，在前列腺增生组织和癌旁组织中，MCT4蛋白均有一定程度表达，但表达水平明显低于前列腺癌组织，差异有统计学意义。MCT4在前列腺癌的阳性表达率可达85.7%，主要表达于间质细胞和肿瘤细胞中，可能与肿瘤细胞间或肿瘤细胞与间质细胞间的乳酸运输有关。另外，MCT4蛋白表达还与前列腺癌是否有淋巴结转移关系密切，淋巴结转移患者阳性表达率明显高于非转移患者，因此，MCT4可能是促进前列腺癌转移的重要因素。在前列腺癌组织中，笔者研究了MCT4蛋白表达与前列腺癌临床病理因素的关系发现，MCT4表达水平在不同前列腺癌的病理分级之间差异无统计学意义。但有报道[13]显示它在CRPC中表达更高，可能参与CRPC形成的进程。Western blotting检测不同细胞系中MCT4表达显示，CRPC的PC-3及DU145细胞中蛋白较高，而雄激素依赖性前列腺癌Lncap及前列腺正常上皮细胞中MCT4表达较弱。在PC-3中应用RNAi抑制MCT4表达后，能明显降低N-cadherin及ERK1/2的表达，而使E-cadherin表达升高，说明MCT4可能参与EMT进程及ERK1/2通路，因此，MCT4作为糖酵解途径中的关键蛋白可能成为潜在的治疗前列腺癌的新靶点[14]。Gao等[15]应用siRNA下调肝癌中MCT4表达，发现可明显降低癌细胞增生、迁移及侵袭。另外，MCT4与尿路上皮侵袭性和预后密切相关，稳定敲除MCT4后可以明显抑制肿瘤细胞生长，减小肿瘤体积[16]。Gerlinger等[17]研究表明，MCT4可降低乳酸分泌，降低细胞内pH和ATP水平，并导致肾透明细胞癌细胞G2/M停滞，诱导细胞凋亡。总之，即使在有氧状态下，肿瘤细胞也会优先进行糖酵解，肿瘤通过瓦伯格效应获取能量，因此肿瘤代谢逐渐成为研究热点[18]。MCT4不仅在糖酵解过程中扮演重要角色，在前列腺癌中还可以调控EMT及ERK信号通路，促进细胞增生、侵袭及转移，并可能最终导致CRPC的发生[19]。

近年来肿瘤代谢研究领域快速发展，以肿瘤治疗为标志的代谢性研究已经成为生物医学研究的热点领域。本研究中样本量相对较小，需进一步扩大样本量，并深入研究MCT4在前列腺癌中的表达和调控机制，以有助于为以MCT4为靶点的治疗提供依据，并为去势抵抗前列腺癌提供新的治疗方案。