人ether-α-go-go钾通道减少肝脏的内质网应激和凋亡

卢 晶 沈 涵 程 呈 刘敬怡 朱晓蓉 谢荣荣 袁明霞 杨金奎

(首都医科大学附属北京同仁医院内分泌科 糖尿病防治研究北京市重点实验室 北京市糖尿病研究所，北京 100730)

葡萄糖代谢是机体复杂的生理过程，包括胰岛素的合成、成熟、分泌等环节。生理状态下，胰岛β细胞感受机体的血糖波动，分泌胰岛素，促进肝脏、肌肉和脂肪的葡萄糖摄取，从而调节血糖至正常水平[1]。内质网是参与细胞内蛋白质折叠、成熟和转运的重要细胞器，也参与细胞内钙稳态及细胞死亡的调节过程。在缺氧、氧化应激或细胞内钙稳态破坏等病理条件下，细胞为了自我保护，启动未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)以应对内质网应激(endoplasmic reticulum, ER)[2]。UPR包括3条主要的信号转导通路，分别由蛋白激酶RNA样内质网激酶(protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase, PERK), 激活转录因子6(activating transcription factor 6, ATF6), 以及肌醇必需激酶1(inositol-requiring kinase1, IRE1)介导[3]。当内质网应激持续存在时，细胞可以诱发UPR的终末期反应——凋亡。已有研究[4-6]显示，C/EBP-同源蛋白(C/EBP-homologous protein, CHOP)和IRE1下游通路参与细胞凋亡。肿瘤坏死因子受体相关因子2(tumor necrosis factor receptor-associated factor 2, TRAF2)，凋亡信号调节激酶1(apoptosis signal-regulating kinase 1, ASK1)/ c-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)以及半胱天冬酶半胱天冬酶12(cleaved-cysteine aspartyl protease-12，cleaved-caspase 12)的激活参与其中。内质网应激介导的肝细胞凋亡与肝脏损伤以及糖代谢异常关系密切。

生理状态下，胰岛β细胞的葡萄糖刺激的胰岛素分泌(glucose-stimulated insulin secretion, GSIS)由一系列电活动调控，主要依赖于ATP敏感性钾通道(ATP-sensitive K+channel， KATP)[7]。除KATP通道外，电压门控ether-α-go-go相关基因(ether-α-go-gorelated gene, ERG)钾通道家族也广泛存在于胰岛细胞。ERG家族属于电压依赖性钾通道，有3个家族成员，分别是Kcnh2编码的ERG1通道，Kcnh6基因编码的ERG2通道以及Kcnh7编码的ERG3[8]。在INS-1细胞中，ERG通道抑制剂E4031可以通过阻断ERG通道，增加胰岛素的分泌[9]。有研究[10]显示，编码的ERG1钾通道参与心脏延迟整流电流。Hyltén-Cavallius等[11]的研究显示，ERG1钾通道突变的患者患有2型长QT间期综合征且胰岛素分泌升高。Rosati等[12]的研究显示，ERG钾通道在人胰岛β细胞分泌胰岛素的调节中具有重要作用。

然而，目前关于人ERG(human ERG, hERG)钾通道和葡萄糖代谢关系的研究较少。本课题组发现一个hERG钾通道杂合突变的糖尿病家系，家系中成年患者表现为低胰岛素血症和糖尿病，前期采用TALEN技术成功构建了hERG基因敲除小鼠动物模型，发现敲除动物存在糖耐量异常，但其具体机制尚未完全阐明[13]。本研究将利用课题组前期构建的hERG基因敲除动物模型进一步探讨hERG基因敲除对存在肝脏内质网应激和凋亡的影响，以及这种影响是否导致了糖耐量异常。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级健康的雄性C57BL/6J小鼠，8周龄，购于北京维通利华实验动物技术有限公司。实验动物许可证号：SCXK(京)2011-0012。采用TALEN技术构建hERG基因敲除小鼠动物模型(C57BL/6J背景)。实验时，雄性hERG敲除小鼠(knockout, KO)与野生对照小鼠(wild type,WT)均为20周龄。饲养在环境温度为20～24 ℃、环境湿度为50%～70%的SPF级动物房内，正常日光周期，自由进食及饮水，保持垫料干燥。

1.2 病理切片的制备

20周龄雄性小鼠，颈椎脱臼处死后，沿腹正中线打开腹腔，小心、迅速分离胰腺组织，将采集的胰腺置于4%(质量分数)多聚甲醛中固定24 h，以备制作石蜡切片。取出4%(质量分数)多聚甲醛固定24 h的胰腺和肝脏组织，梯度乙醇脱水，二甲苯中透明，将充分透明的胰腺组织块放于融化的石蜡中，置于熔蜡箱内保温。石蜡完全浸入组织块后，进行包埋。将包埋好的胰腺组织蜡块、肝脏组织蜡块固定在切片机上，切成厚度为5 μm的薄片，薄片在预热的水中烫平后贴于挂胶载玻片上，恒温箱中烤干，以备染色用。

1.3 RNA的提取和荧光实时定量PCR

采用天根细胞组织总RNA提取试剂盒(货号DP419)提取RNA，采用天根FastQuant cDNA第一链合成预混试剂(货号KR108)合成cDNA。β-actin基因作为内参。采用Light Cycler 96仪器 (美国Roche公司)检测RNA的表达情况。PCR反应体系为20 μL:2×酶混合物(Transgen Biotech公司, 货号AS111) 10 μL、正向引物1 μL(10 μmol/L)、反向引物1 μL(10 μmol/L)、 cDNA 1.5 μL、DEPC H2O 6.5 μL。扩增条件为94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，40个循环后再72 ℃ 7 min，自然冷却至室温。所用引物详见表1。

表1 实验用引物序列Tab.1 Primers used in the experiment

1.4 Western blotting

采用BCA蛋白分析试剂盒 (中国碧云天公司)测定蛋白浓度。取80 μg总蛋白进行10%(质量分数)的SDS-PAGE电泳，湿转(200 mA，120 min)至硝酸纤维膜上。用TBST配制的5%(质量分数)的脱脂奶粉室温封闭1.5 h，用封闭液将一抗稀释后与膜在4 ℃摇床孵育过夜，次日用TBST洗膜3次，每次5 min，再与辣根过氧化物酶(horseradish Peroxidase, HRP)标记的二抗(1∶2 000)室温孵育1 h。TBST洗涤，滴加增强化学发光(enhanced chemiluminescence, ECL)发光液后用Chemi-Doc Touch凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)显影成像，并用Image J软件对图像进行灰度分析。所用抗体,详见表2。

hERG: humanether-a-go-gorelated gene ;CHOP: C/EBP-homologous protein;caspase3: cysteine aspartyl protease 3；BIP(GRP78): binding immunoglobulin protein;ATF4: activating transcription factor 4;p-JNK: phosphorylated-c-Jun N-terminal kinase;JNK: c-Jun N-terminal kinase;Bax: Bcl2 associated X protein;Bcl2: B-cell lymphoma 2.

1.5 慢病毒感染

构建hERG的慢病毒LV载体。12周龄的雄性KO小鼠尾静脉一次性注射慢病毒载体，慢病毒注射剂量为KO组：LV-hERG，WT组：LV-GFP，7×104 TU/g。两周后处死小鼠，用Western blotting法检测小鼠肝脏的内质网应激与凋亡的相关蛋白的表达水平。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 hERG敲除小鼠肝脏形态学

小鼠20周龄时，分别检测KO小鼠及其同窝WT小鼠的体质量及摄食量，二者差异均无统计学意义(图1A、B)。小鼠颈椎脱臼处死后，分离小鼠肝脏，制备石蜡切片，行HE染色，显微镜下观察。结果显示，高倍镜下，WT小鼠的肝细胞胞质丰富，胞核呈圆形或椭圆形，偶见双核，肝血窦清晰可见，未见明显的病理变化；KO小鼠的肝细胞轻度肿胀，胞质呈颗粒状，肝血窦几乎消失(图1C)。

2.2 糖代谢关键酶在肝脏的表达

分离KO小鼠及同窝WT小鼠肝脏，Western blotting法检测上述两种糖异生关键酶在肝脏的表达，结果显示与WT相比，葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6-phosphatase, G6pase)表达无明显变化，磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase, PEPCK)表达上调(P<0.01)，提示hERG敲除可能引起肝脏糖代谢异常，详见图2、表3。

图1 hERG敲除小鼠肝脏形态学Fig.1 Liver morphology of hERG knockout mice

A:weight of the mice;B: food intake of the mice;C: HE staining of the mice(100×);hERG: humanether-a-go-gorelated gene;WT: wide type;KO: knockout;n=6.

图2 Western blotting检测糖异生关键酶在小鼠肝脏的表达Fig.2 Expression level of the gluconeogenesis related key enzyme in the liver measured with Western blotting

* *P<0.01vsWT;WT: wide type;KO: knockout;G6pase: glucose-6-phosphatase;PEPCK: phosphoenolpyruvate carboxykinase.

表3 Western blotting法检测糖异生关键酶在小鼠肝脏的表达水平Tab.3 Expression level of the gluconeogenesis related key enzyme in the liver measured with Western blotting

WT: wide type;KO: knockout;G6pase: glucose-6-phosphatase;PEPCK: phosphoenolpyruvate carboxykinase.

2.3 hERG敲除小鼠肝细胞凋亡增加

为研究肝脏变化的可能机制，对小鼠肝脏进行了凋亡相关指标的检测。利用Western blotting的方法检测肝组织中，凋亡相关蛋白的表达。结果显示，与WT相比，KO小鼠肝脏的半胱天冬酶半胱天冬酶3(cleaved-cysteine aspartyl protease 3，cleaved-caspase 3)，B细胞淋巴瘤因子2(B-cell lymphoma 2，Bcl2) 的表达上调和Bcl2相关X蛋白(Bcl2 associated X protein，Bax)表达下调，详见图3、表4。综上，hERG敲除可以使小鼠肝细胞的凋亡增加。

图3 Western blotting检测小鼠肝脏凋亡相关蛋白表达Fig.3 Expression level of the apoptosis-related protein in the liver measured with Western blotting

*P<0.05vsWT group,n=3;WT: wide type;KO: knockout;p-JNK: phosphorylated-c-Jun N-terminal kinase;JNK: c-Jun N-terminal kinase;Bax: Bcl2 associated X protein;Bcl2: B-cell lymphoma 2;caspase3: cysteine aspartyl protease 3.

表4 Western blotting法检测小鼠肝脏凋亡相关蛋白表达水平Tab.4 Expression level of the apoptosis-related protein in the liver measured with Western blotting

2.4 hERG敲除小鼠肝脏内质网应激水平增加

为进一步研究肝细胞凋亡是否与内质网应激有关，检测了肝脏内质网应激相关蛋白的表达水平。real-time qPCR检测结果显示，KO小鼠的肝脏中结合免疫球蛋白的蛋白质(binding immunoglobulin protein, BIP)、CHOP、ATF4及ATF6的mRNA上调(图4A)。Western blotting结果显示，与WT小鼠相比，KO小鼠的肝脏中BIP(GRP78)、磷酸化真核细胞翻译起始因子2(phosphorylated-eukaryotic translation initiation factor 2α, p-eIF2α)、ATF4以及CHOP的蛋白浓度上调(图4B，表5)。综上，hERG敲除小鼠的肝脏内质网应激水平上调。

图4 小鼠肝脏内质网应激相关蛋白的表达Fig.4 Expression level of endoplasmic reticulum stress related protein in mouse liver using Western blotting

A： mRNA expression levels of stress related proteins in the liver using real-time PCR；B： protein levels of stress related proteins in the liver measured with Western blotting;*P<0.05,* *P<0.01vsWT group；hERG: humanether-a-go-gorelated gene ;WT: wide type;KO: knockout;BIP(GRP78): binding immunoglobulin protein;p-eIF2α:phosphorylated-eukaryotic translation initiation factor 2α;eIF2a: eukaryotic translation initiation factor 2α;ATF4: activating transcription factor 4;ATF6: activating transcription factor 6;CHOP: C/EBP-homologous protein.

WT: wide type;KO: knockout;hERG: humanether-a-go-gorelated gene;BIP(GRP78): binding immunoglobulin protein;eIF2a: eukaryotic translation initiation factor 2α;ATF4: activating transcription factor 4;CHOP: C/EBP-homologous protein.

2.5 hERG在体内过表达减轻肝脏内质网应激及凋亡

为进一步探究hERG在体内过表达能否改善 KO小鼠肝脏的内质网应激和凋亡，构建了hERG的慢病毒载体注射到实验动物体内，两周后处死小鼠，用Western blotting法检测小鼠肝脏的内质网应激与凋亡的相关蛋白的表达水平。结果显示与注射LV-GFP的对照组小鼠相比，LV-hERG组小鼠肝脏hERG表达明显上调，显示模型构建成功(图5A)。LV-hERG组的ATF4及CHOP等内质网应激相关的蛋白表达水平下调，提示hERG过表达对小鼠肝脏内质网应激有保护作用。同时，Western blotting结果显示，凋亡相关蛋白中，Bcl2的表达有上调趋势(P=0.09)，Bax、cleaved-caspase 3的表达下调，提示hERG过表达可改善小鼠肝细胞的凋亡(图5B，表6)。综上，hERG在体内过表达可以减轻肝脏的内质网应激和凋亡。

图5 Western blotting法检测小鼠肝脏内质网应激及凋亡相关蛋白的表达Fig.5 Expression levels of endoplasmic reticulum stress and apoptosis related proteins using Western blotting

A:hERG expression level of KO mice with LV-GFP or LV-hERG;B:expression levels of endoplasmic reticulum stress and apoptosis-related proteins;*P<0.05,* *P<0.01,** *P<0.001vsLV-GFP;hERG: humanether-a-go-gorelated gene;ATF4: activating transcription factor 4;CHOP: C/EBP-homologous protein;Bcl2: B-cell lymphoma 2.Bax: Bcl2 associated X protein;caspase3: cysteine aspartyl protease 3.

3 讨论

肝细胞凋亡是导致肝脏损伤以及肝脏疾病的重要环节，内质网是真核细胞中参与细胞内跨膜蛋白与分泌蛋白合成、加工、修饰以及转运的重要细胞器。内源性或外源性刺激引发的内质网蛋白折叠功能异常所导致的这种细胞应激状态，称为内质网应激。Ruiz-Vela等[14]的研究显示，牛磺熊去氧胆酸可以通过抑制细胞内钙离子的释放而抑制内质网应激介导的肝细胞凋亡；可以降低胡萝卜素诱导的细胞内钙离子的上调，改善GRP78的过度表达，抑制Caspase12的激活，从而减轻肝细胞凋亡。

表6 Western blotting检测小鼠肝脏内质网应激及凋亡相关蛋白的表达水平Tab.6 Expression level of endoplasmic reticulum stress and apoptosis-related proteins in the liver measured with Western blotting

肝脏在葡萄糖代谢，尤其是糖异生过程中发挥重要作用。糖异生是指乳酸、甘油以及生糖氨基酸等简单的非糖前体，在一系列酶的催化作用下，转变为葡萄糖或糖原的过程，它为机体血糖稳态提供了重要保证。G6pase是糖异生过程的关键酶，通过水解葡萄糖-6-磷酸盐生成葡萄糖，在维持机体血糖稳态中发挥重要作用[15]。PEPCK是糖异生过程的另一种关键酶，在PEPCK作用下，将草酰乙酸转化为磷酸烯醇式丙酮酸，经过一系列后续反应后最终生成葡萄糖[16]。本研究显示，与同周龄WT小鼠相比，KO小鼠的糖异生关键酶PEPCK的表达上调，提示可能发生糖代谢异常，这一结果与课题组前期证实的KO小鼠存在糖耐量异常一致[13]。

KO小鼠肝脏内质网应激相关蛋白GRP78、p-eIF2α、ATF4和CHOP的转录和蛋白表达上调；凋亡相关蛋白cleaved-caspase3、Bax的表达上调，Bcl2表达下调。这一结果提示KO小鼠体内存在肝脏的内质网应激和凋亡。经尾静脉向KO小鼠注射LV-hERG，Western bloting检测结果显示在KO小鼠体内，注射hERG病毒的小鼠有hERG基因表达，而注射GFP基因的小鼠体内没有hERG表达，说明模型构建成功。结果显示体内过表达hERG可以下调ATF4、CHOP、cleaved-caspase3等蛋白的表达。综上，hERG可以通过改善肝脏的内质网应激与凋亡从而调节糖代谢。

本研究的局限性在于，没有找到hERG与内质网应激反应的直接作用媒介以明确阐明hERG对内质网应激和细胞凋亡保护作用的机制。在后期的研究中，拟考虑通过免疫共沉淀等方法，寻找与hERG直接作用的分子。但可以明确的是，hERG对肝脏的内质网应激和凋亡具有保护作用，进而发挥改善糖代谢的作用。本研究可以为内质网钙耗竭诱导的β细胞功能障碍的原因和hERG激动剂治疗糖尿病的可能性提供新的见解。