复合保鲜剂协同超高压对鲈鱼贮藏品质的影响

郭丽萍，乔 宇，熊光权，*，廖 李，汪 兰，吴文锦，丁安子，李 新，石 柳

(1.宁波大学海洋学院，浙江宁波315211;2.湖北省农业科学院农产品加工与核农技术研究所，湖北武汉430064)

鲈鱼又名花鲈、寨花、鲈板、四肋鱼等，广泛分布于 太平洋西部、中国沿海及淡水水体中，是常见的经济鱼类之一，也是发展海水养殖的主要品种［1］。其肉质鲜嫩，骨刺较少，且营养价值丰富，是水产品中的珍品，因此深受消费者的青睐［2］。然而，由于鲈鱼中水分与蛋白质含量较高，肌肉组织脆弱，内源性蛋白酶活跃，自溶速度快，同时鱼体内还携有大量细菌，在储运加工过程中极易腐败变质，从而降低了产品的商业价值［3］。因此，如何有效延长水产品的货架期、保持其良好的品质已成为国内外水产学者关注的热点。

水产品保鲜主要利用人为可控措施，采用物理、生物、化学手段来延缓(抑制)鱼贝类腐败微生物的繁殖、降低水解嘛的活性、减缓脂质氧化，以保持水产品原有的鲜度质量、食用质量与商品价值［4］。在国内，水产品的传统保鲜方法主要有低温保藏或者冻结贮藏，然而传统的保藏方法不能有效地抑制微生物生长和维持水产品品质［5］。于是催生了现代的保鲜方式:高压保鲜技术、气调保鲜技术、辐照保鲜技术、生物保鲜技术以及化学保鲜技术［6］。气调保鲜技术(Modified atmosphere packaging，MAP)是以不同于大气组成或浓度的混合气体来替换食品所处空间的空气，由于氧气的缺乏，以此抑制或减缓微生物的繁殖和脂肪的氧化变质，从而有效保持水产品的品质，延长水产品货架期的包装方法［7］。但是气调保鲜需要一定的设备，操作繁琐且价格较贵，不适合大规模的使用。辐照保鲜技术是利用物理射线破坏微生物的DNA，导致其不能生长繁殖，此外还可破坏细菌细胞膜的功能，阻碍微生物的代谢活动，达到杀菌保鲜的目的［8］。短波射线辐照(如紫外线辐照)易分解食品中的一些有益成分(维生素、叶绿素)，还会造成食品中的脂肪氧化、蛋白质变质，产生色变和臭味等现象;另外，射线辐照易对操作人员造成伤害，因此辐照保鲜技术不易于广泛应用［9］。生物技术广泛应用于工业、农业、医药和食品行业，生物保鲜技术对产品危害小，具有广阔的发展前景。但是，生物保鲜剂成本高、技术尚不成熟，因此生物保鲜技术仍然需要改进和创新［10］。生物保鲜剂安全性高、专一性强，不仅可以保持水产品的鲜度和营养，而且可以加强保鲜的抑菌效果，从而有效地延长水产品的货架期［11］。但是保鲜过程中也存在药物残留问题，这将危害到消费者的健康，还有一些生物保鲜剂自身有特殊气味或颜色，会对水产品的商品价值造成影响［12］。

高压保鲜技术是一种高压灭菌技术，可以杀菌并使酶失活，从而保存食品的风味和营养。超高压技术在果蔬保鲜方面使用较多，利用高压静电保鲜果蔬，具有能耗小、操作简便、无污染等特点，对果蔬的影响小，但在水产品保鲜方面研究较少［13］。本文采用超高压技术与复合生物保鲜剂结合，以新鲜鲈鱼为对象，从菌落总数、pH、挥发性盐基氮、色泽、剪切力等方面研究其对鲈鱼贮藏品质的影响，以期为水产品贮藏与运输及品质控制提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜鲈鱼 选择个体大小一致，重量0.4～0.6 kg，鱼体鱼鳍无破损，鱼鳃鲜红，鱼眼饱满，黑白分明无浑浊，肉质弹性较好，冰藏条件下30 min以内运输至实验室进行处理，湖北省武汉市武商量贩农科院店;真空高温蒸煮袋 (8 cm×8 cm，PE材质，南京建成生物公司;盐酸、氯化钠、轻质氧化镁、无水乙醇、冰醋酸、硼酸、氢氧化钠、氯化钾 分析纯，国药集团化学试剂有限公司;壳聚糖、ε－聚赖氨酸、茶多酚、乳酸链球菌素(nisin) 食用级，国药集团化学试剂有限公司;溴甲酚绿、甲基红、次甲基蓝 指示剂，连云港市鑫源化工股份有限公司;营养琼脂 分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

FG2型pH计 梅特勒－托利多仪器(上海)有限公司;L2－600MPa/2L型超高压处理机 天津华泰森淼生物工程技术股份有限公司;BS－210型电子天平 德国Sartorius Instruments有限公司;CR－400型色差计 柯尼卡美能达株式会社;DGX－9143B型电热恒温鼓风干燥箱 上海雷磁仪器生产厂;SPX－250B－Z型生化培养箱 上海博讯实业有限公司医疗设备厂;TA－XT Plus型质构仪 英国Stable Micro Systems公司;JHK－A型洁净工作台 天津市中环实验电炉有限公司;DZD－600/S2E型真空包装机 燕城神州食品机械(北京)有限公司;GL－25MS型高速冷冻离心机 上海卢湘仪离心机仪器有限公司;FOX40000型电子鼻 法国阿尔法莫斯仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 保鲜剂的筛选 将新鲜鲈鱼用碎冰冻死，去除头尾和内脏、取背部肌肉，切成大小适宜的鱼块，约为(10±1)g，分别采用0.50%浓度的茶多酚、nisin、壳聚糖及ε－聚赖氨酸和灭菌后的蒸馏水浸泡(30 min)，淋干，用灭菌蒸煮袋包装置于4℃条件下贮藏2 d后，测定其菌落总数。

1.2.2 保鲜剂最适浓度的筛选 鲈鱼前处理同

1.2.1 ，分别采用 0.10%、0.50%、1.00% 、1.50%、2.00%ε－聚赖氨酸和0.05%、0.15%、0.30%、0.40%、0.50%壳聚糖以及灭菌后的蒸馏水浸泡(30 min)，淋干，同时设置一组仅用200 MPa超高压处理5 min的鲈鱼样品，然后置于4℃条件下贮藏2 d后，测定其菌落总数。

1.2.3 复合保鲜剂结合超高压处理 鲈鱼前处理同

1.2.1 ，分别对其采用灭菌后的蒸馏水和0.15%壳聚糖结合0.50% ε－聚赖氨酸、1.50% ε－聚赖氨酸的混合液浸泡(30 min)，淋干，用灭菌蒸煮袋包装，编号为处理组 1、2、3，然后再用200 MPa的超高压处理5 min，同时设置对照组(不经过任何处理的)，置于4 ℃条件下贮藏。样品于0、3、6、9、12 d进行测定分析。每个分析处理3次。

1.2.4 p H的测定 取10.0 g鱼肉样品，剪碎，加入去离子水100 mL，均质后静置30 min。过滤，取滤液50 mL，用 pH计测定。每个处理测定3次，取平均值。［14］。

1.2.5 菌落总数的测定 参照 GB 4789.2－2016［15］。取10 g鱼肉剪碎并加入90 mL灭菌处理的生理盐水，充分振荡，根据样品保藏时间及样品新鲜度，制备稀释样品悬浊液。采用稀释平板计数法，取1.0 mL样品悬浊液接种于营养琼脂培养基中，适当摇匀，冷却凝固后，翻转平板，放置在30℃恒温箱内培养72 h，进行菌落计数。

1.2.6 白度的测定 测量前剥开鱼肉表皮，暴露出肌肉。用便携式色差计测定L*(亮度)、a*(红度)和b*(黄度)值，计算白度，每个样品重复测3次，取平均值［16］。

1.2.7 剪切力的测定及参数 采用质构仪测定，以剪切力来衡量鲈鱼嫩度。采用剪切探头HDP/BS，压缩测试模式:测前速度为 2.00 mm/s，测中速度1.00 mm/s，测后速度1.00 mm/s;距离20.0 mm，触发应力 20.0 g［17］。

1.2.8 挥发性盐基氮(TVB－N)含量的测定 根据GB/T 5009.44－2003［18］，称取约 10.00 g 绞碎试样，置于100 mL烧杯中，摇匀，用高速均质机均质1 min，浸渍30 min后过滤，滤液置冰箱备用。整流滴定:将盛有10 mL吸收液及5～6滴混合指示剂的锥形瓶置于冷凝管下端，并将其下端插入吸收液的液面下，准确吸收5.0 mL上述样品滤液于整流器反应室内，加入氧化镁混悬液，迅速盖塞，并加水以防漏气，通入蒸汽，进行蒸馏，蒸馏5 min即停止，吸收液用标准盐酸溶液滴定，终点为蓝紫色，同时进行空白试验。

式中:X－样品中挥发性盐基氮的含量，mg/100 g;V1－盐酸标准溶液用mL;V2－空白试验中盐酸标准溶液用量，mL;C1－盐酸的浓度，mol/L;m－样品的质量，g。

1.3 数据处理

实验数据均取3次平行实验的平均值，采用软件Excel绘制曲线，数据间差异通过统计软件SPSS 22.0中的Duncan新复极差法进行方差分析和多重比较，结果以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 保鲜剂的筛选

从图1中，可以看出壳聚糖和ε－聚赖氨酸的抑菌效果是较好的，在菌落数总数上，壳聚糖、ε－聚赖氨酸＜nisin＜茶多酚、对照组(p＜0.05)。李小芳等［19］研究了壳聚糖对革兰氏阴性菌的抑菌机理，结果表明，革兰氏阴性菌表面所带的负电荷越多，且其亲水性越好，壳聚糖的抑菌性能越好;壳聚糖可增加细胞膜的通透性，壳聚糖与细胞膜间可发生静电作用，从而使细胞膜破坏，最终导致菌体的死亡。因此，本文选用壳聚糖和ε－聚赖氨酸作为两种常见抑菌剂进行复配。

图1 不同保鲜剂处理的菌落总数(lgCFU/g)变化Fig.1 The change of total colony number(lgCFU/g)with different preservatives treatments

2.2 保鲜剂浓度的确定

由图2和图3可以看出，ε－聚赖氨酸和壳聚糖处理组的菌落总数显著低于对照组(p＜0.05)，表现出良好的抑菌效果。ε－聚赖氨酸的浓度在0.10%～2.00%时，随着浓度的增加，菌落总数逐渐减少，当浓度达到1.50%时，浓度再增加，菌落总数变化率逐渐平缓，而0.1%、0.50%与1.00%时的菌落总数无显著性差异(p＞0.05)。因此，本研究中选取浓度为0.50%和1.50%的ε－聚赖氨酸作为复合保鲜剂的浓度;壳聚糖的浓度在0.05%～0.50%时，菌落总数呈现逐渐降低的趋势，但是考虑到壳聚糖溶解较难，且随着浓度的增加，溶液会越粘稠，会影响到食品感官品质，同时考虑到经济成本的原因，0.05%与0.15%的浓度较为合适，且参考食品添加剂的使用标准，最后选择0.15%作为复合保鲜剂的复配浓度。

图2 ε－聚赖氨酸处理对菌落总数的影响Fig.2 Effect ofε－polylysine treatment on the total number of colonies

图3 壳聚糖处理对菌落总数的影响Fig.3 Effect of chitosan treatment on total number of colonies

2.3 复合保鲜剂结合超高压

2.3.1 菌落总数的变化 菌落总数的变化可反映蛋白质和氨基酸分解代谢情况，是衡量鲈鱼腐败程度的重要参数之一［20］。一般，菌落总数(个/g)≤105为一级鲜度，≤5×105个/g为二级鲜度，106～107个/g表明鱼类已经腐败［21］。鱼类在刚捕获时微生物的多少主要取决于其生存环境下的微生物数量。鱼体死后，随着贮藏时间的延长，体内微生物开始增长和繁殖，从而成为导致鱼肉腐败变质的主要原因［22］。从表1可知，超高压处理后，鲈鱼的菌落总数显著降低(p＜0.05)，在一定程度上抑制了腐败微生物的生长和繁殖，其中复合保鲜剂结合超高压处理(处理2和3)与单一超高压处理相比，在第0 d时菌落总数就显著降低(p＜0.05)，说明其抑菌效果更好。同时，从表1的结果可以看出，随着贮藏时间的延长，菌落总数呈现增长趋势。对照组样品的菌落总数在第6 d已经达到(6.56±0.03)lg CFU/g，样品已经腐败。处理组1在第9 d时菌落总数达到(6.58±0.02)lg CFU/g，开始腐败。而处理组2、3此时的菌落总数对数值还未超过6 lg CFU/g，结果表明，超高压处理结合复合保鲜剂处理能使冷藏鲈鱼片的货架期得到相应延长。0.15%壳聚糖+1.50% ε－聚赖氨酸的处理(处理组3)对菌落总数的抑制效果最好。谢晶等［23］在生物抗氧化剂结合超高压技术对冷藏带鱼的保鲜效果的研究中，发现在一定超高压的基础上，结合一定的生物抗氧化剂，可以有效地减少菌落总数。

表1 复合生物保鲜剂结合超高压对鲈鱼贮藏期间菌落总数的影响(lgCFU/g)Table 1 Effect of combined bio－preservatives combined with UHP on the total number of colonies of perch during storage(lgCFU/g)

2.3.2 挥发性盐基氮(TVB－N)含量的变化 TVB－N是判断水产品腐败变质程度的一个重要指标，它是由于动物性食品肌肉中的内源酶或细菌作用，使蛋白质分解产生氨及胺类等碱性含氮挥发性物质［24］。TVB－N变化率越大，腐败越严重。在保藏期间，鲈鱼肉中所含TVB－N的量持续增大，这表示鱼肉的腐败越来越重，TVB－N值可以很好地表示出鱼肉的腐败程度。随着贮藏时间的延长，样品组中的TVB－N值显著增加(p＜0.05)。从表2可知，经过处理的样品组TVB－N值显著低于对照组(p＜0.05)，从第0 d开始，处理组2和3，即0.15%壳聚糖+0.50% ε－聚赖氨酸和0.15%壳聚糖+1.50% ε－聚赖氨酸高压处理组的TVB－N值显著低于处理组1(p＜0.05)，可以在一定程度上抑制微生物的生长，延缓蛋白质的分解，从而减少鱼肉中TVB－N值的增加。根据《食品安全国家标准鲜、冻动物性水产品GB2073－2015》中规定［25］，淡水鱼虾的 TVB－N 值大于20 mg/100 g时鱼已腐败。从表2中可以看出，对照组和处理组1在第6 d时TVB－N值已经超过20 mg/100 g，而处理组2和3在第9 d才超过20 mg/100 g，说明超高压结合复合保鲜剂处理能明显延缓样品TVB－N值的升高。在第12 d时，处理组3的TVB－N值小于处理组2，可以说明处理组3具有较好的抑菌效果和保鲜能力。

表2 复合生物保鲜剂结合超高压对鲈鱼贮藏期间挥发性盐基氮含量的影响(mg/100 g)Table 2 Effects of combined bio－preservatives and UHP on volatile basic of perch nitrogen content during storage(mg/100 g)

2.3.3 pH的变化 冷藏期间鱼肉pH的变化如表3所示，所有组中pH均呈现先降低后上升的趋势，整个贮藏期呈“V”字形。这与Fan等［26］报道的结果一致。pH的降低可能与鱼肉中糖原的含量和肌肉的缓冲能力有关。鱼死后三磷酸腺苷(ATP)和磷酸肌酸等物质分解产生磷酸等酸性物质［27］，同时糖原酶解产生乳酸，使pH降低。随后，随着贮藏时间的延长，蛋白质分解产生三甲胺、二甲胺和氨等挥发性盐组成的化合物，由于碱性物质含量的增加，最终导致鱼肉的pH升高［28］。由表3可以看出，经过超高压处理的实验组，在第0 d的p H显著高于对照组(p＜0.05)，这与其他学者的研究结果一致。孟辉辉等［29］利用超高压处理毛蚶脱壳，发现超高压处理组毛蚶肉的pH显著高于对照组;Cruz－Romero等［30］对牡蛎及Ramire－zsuarez等［31］对长鳍金枪鱼的研究中也得到类似的结果。在第6 d时，处理组2、3(即0.15%壳聚糖结合0.50%ε－聚赖氨酸和1.50% ε－聚赖氨酸处理组)的pH显著高于处理组1(p＜0.05)，它们能够延缓糖类的分解，从而使pH缓慢降低。在9～12 d，处理组2、3可以有效地抑制微生物的生长，从而延缓蛋白质的分解，使pH缓慢升高。在第12 d时，处理组2、3的pH显著低于处理组1和对照组，同时处理组2的p H高于处理组3，说明处理组3的抑菌效果优于处理组2。

表3 复合生物保鲜剂结合超高压对鲈鱼在贮藏期间pH的影响Table 3 Effect of composite bio－preservatives combined with UHPon the pH of perch during storage

2.3.4 白度的变化 色泽是一个重要的食品品质的指标，影响产品的外观表现，可能决定消费者的购买欲望。同时，在保藏期间，鱼肉的颜色可能会由于脂肪发生氧化、色素出现降解等反应而发生一定程度的变化，导致消费者的可接受度下降［32］。

从表4可以看出，经过超高压处理的实验组，在白度上显著高于对照组(p＜0.05)，主要是由于一定的压力会使鲈鱼鱼肉出现熟化，从而使其白度有所提高，同时由于超高压处理引起肌原纤维蛋白和肌浆蛋白变性，从而使鱼肉表面颜色发生改变［33］。马海建等［34］以草鱼鱼肉为原料，当压力大于等于200 MPa时，鱼肉白度增大，色泽有所改变，产生熟化外观，与本文结果类似。同时在第0 d时，与对照组相比，壳聚糖和ε－聚赖氨酸的添加使鱼肉的白度显著增加(p＜0.05)。随着贮藏时间的延长，鲈鱼肉质的白度逐渐增大。其中，在第3 d时，1、2和3处理组的样品白度均显著高于对照组(p＜0.05)，这是因为1、2和3处理组均进行了超高压处理，加速了鱼肉的熟化，使样品白度增加。第6 d时，处理组1、2和对照组无显著性差异(p＞0.05)，处理3显著低于对照组(p＜0.05)，说明处理组3可以有效地延缓白度的增加。第9 d开始，白度变化趋势呈现为处理组3＜处理组2＜处理组1＜对照组，随着贮藏时间的增加，样品白度逐渐增大，这可能是由鲈鱼的脂肪氧化和蛋白质分解导致，而腐败微生物是引起这个现象产生的主要原因。而壳聚糖和ε－聚赖氨酸可以抑制这些微生物的生长，从而延缓其中蛋白质和脂肪的分解，因此在贮藏后期能够延缓鱼肉白度的增加。

表4 复合生物保鲜剂结合超高压对鲈鱼在贮藏期间白度的影响Table 4 Effects of biological preservatives combined with UHP on whiteness of perch during storage

2.3.5 剪切力的变化 剪切力是评价肉制品食用物理特性的重要指标，它反映了肉中各种蛋白质的结构特性、脂肪的分布状态，剪切力与嫩度成反比。剪切力变化率越低，说明食品新鲜度保持越好。由表5可知，通过一定超高压处理后的实验组，其剪切力显著增加(p＜0.05)，有研究报道，超高压处理可以修饰肌原纤维蛋白质，进而会对鱼肉质构产生影响［35］。同时，壳聚糖的添加也使得鱼肉的剪切力增加，从而降低了其嫩度(p＜0.05)。随着贮藏时间的延长，由于腐败微生物的生长繁殖，分解其中营养物质，导致鱼肉的新鲜度不断下降。但是，处理组2和3(即0.15%壳聚糖分别结合0.50% ε－聚赖氨酸和1.50%ε－聚赖氨酸的混合液)可以明显减缓鱼肉的腐败速度，使其嫩度缓慢下降。由表5可以看出，从第0 d开始，剪切力高低顺序均为处理组3＞处理组2＞处理组1＞对照组，且存在显著性差异(p＜0.05)。同时，通过表5可以看出，处理组3的剪切变化率一直保持最低(p＜0.05)，说明处理组3的保鲜效果明显由于其他三组。随着贮藏时间的延长，由于微生物和酶的作用，使鱼肉逐渐分解与腐败，从而使其剪切力不断下降。

表5 复合生物保鲜剂结合超高压对鲈鱼在贮藏期间剪切力的影响Table 5 Effect of composite bio－preservatives combined with UHPon the shear stress of perch during storage

3 结论

选用4种常见的单一抑菌剂(茶多酚、nisin、壳聚糖和聚赖氨酸)，对鲈鱼的主要优势腐败菌进行抑菌效果验证，发现壳聚糖和ε－聚赖氨酸具有较好的抑菌效果，在一定贮藏时间里可以延缓鲈鱼的腐败变质。通过对壳聚糖和ε－聚赖氨酸浓度的确定，壳聚糖为 0.05%～0.50%，ε－聚赖氨酸为 0.10%～2.00%，综合成本等方面的考虑，最终将壳聚糖的浓度确定为0.15%，ε－聚赖氨酸的浓度为0.50%和1.50%。然后将2种抑菌剂进行复配，结合一定强度的超高压，本文选用了200 MPa处理5 min作为超高压处理条件。通过以上的研究结果，可以看出超高压协同0.15%壳聚糖和1.50% ε－聚赖氨酸混合液的处理方式抑菌效果优于其他3组，因此单一的超高压和抑菌剂效果并不理想，多种保鲜技术所形成的栅栏效应，可以更好地抑制微生物的生长，从而有效地延缓食品的腐败，延长食品货架期。

由于复合保鲜剂的配制过程简单，且使用简便，同时其可生物降解，对环境无污染，因而适用于鲈鱼等水产品的长距离运输、销售与贮藏过程中的保鲜，可适用于今后工业化的批量生产，具有良好的开发应用前景。