微生物法快速测定食品中叶酸含量范围

田 浩，王志伟，顾文佳，曲勤凤

(上海市质量监督检验技术研究院，上海200233)

叶酸，是一种重要的水溶性B族维生素，作为一碳单位的重要前体物质，参与到人体内许多重要的细胞通路循环中，包括DNA、RNA和蛋白质的甲基化和DNA合成、修复等［1］。居民膳食中的新鲜水果、蔬菜和肉类等食品富含天然叶酸，然而天然叶酸并不稳定，容易在食物的储存、烹饪过程中损失［2］。人工合成的叶酸性质稳定，被广泛用作营养强化剂［3］。学界普遍认为，叶酸强化食品可以降低神经管缺陷风险［4］，并推荐孕产妇群体补充叶酸［5－6］。国家强制标准规定叶酸是婴幼儿配方食品、特殊医学用途配方食品等食品的必需成分，消费者也越来越重视食品中维生素的含量。在此背景下，食品企业相继加大了强化叶酸食品的研发力度。

国标《GB 5009.211－2014食品安全国家标准食品中叶酸的测定》是现行有效的叶酸检测标准，其主要原理是利用鼠李糖乳杆菌Lactobacillus casei spp.Rhamnosus(ATCC 7469)生长过程中对叶酸需求的特异性，在一定控制条件下，将鼠李糖乳杆菌液接种至预先加入待测样品提取液的培养液中，根据叶酸含量与透光率(或吸光度值)的标准曲线，计算出待测样品中叶酸的含量。该国标方法规定了三大类食品的测定方法，包括果蔬类，蛋白质、淀粉含量高的试样和营养强化剂和强化食品［7］。此外，针对不同含量叶酸食品的测定，国内外学者也提出了许多相应的方法，主要有化学发光测定法［8］、高效液相色谱法［9－13］、分光光度法［14－16］、ELISA 法［17－18］、改良微生物法［19－23］等。这些方法各有优势，对叶酸含量较高、较低样品的测定均有探讨，所用方法的检测时长不一，检测灵敏度也有所差别［24］。国标所使用的微生物法通常耗时3～4 d，且步骤复杂，对检测人员素质和所用仪器状态要求很高。当需要测定叶酸含量范围未知的样品时，检测人员很难确定样品称样量。因此，对国标方法进行改进和优化是十分必要的。

本文在国标GB 5009.211－2014方法的基础上进行了改进，利用鼠李糖乳杆菌生长过程中对叶酸需求的特异性，使用一次性离心管替代玻璃试管作为培养容器，同时将整个培养体系缩小至1 mL，培养时间缩短为8～12 h，在对得到的吸光度数据简单换算后，得到待测样品叶酸含量范围，并进行方法学考察，与国标法进行对比，判断其是否具有可行性，为最终使用国标方法准确测定提供样品叶酸含量范围的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

叶酸标准品 Supelco，纯度≥97%;婴幼儿配方乳粉 市售;复合维生素预混料、孕妇饼干 市售;叶酸含量不明的植物提取物1(液态)、植物提取物2(固态) 科研样品，云南农业大学;鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus casei)ATCC 7469 北京陆桥;叶酸测定用培养基 (碧迪);甲盐溶液、乙盐溶液、琼脂培养基 按国标要求配制;改良MARS培养基 北京陆桥;所有试剂 均为分析纯。

SX－700高压灭菌锅 TOMY;SHP－250恒温培养箱 SHELLAB;infinite M200全波长多功能微孔板分析系统 TECAN;Vortex Genie 2涡旋振荡器 美国 Scientific Industrise，Inc。

1.2 实验方法

1.2.1 工作菌液培养物的制备 将保存的鼠李糖乳杆菌转接至琼脂培养基上，在(37±1)℃恒温培养箱中培养20～24 h，再传种1代。挑取单菌落到叶酸测定用培养基，(36±1)℃在培养箱中培养24 h。随后，移取1 mL上述带菌培养液，加入2 mL无菌离心管中，再加入1 mL无菌甘油，放入－20℃冰箱中储存［25］。每批储存菌液可保存3个月。使用时，吸取0.5 mL储存菌液接种到10 mL叶酸测定用培养基，(36±1)℃活化培养6 h后即可作为工作菌液培养物立即使用。若不能立即使用，工作菌液培养物在4℃冰箱中可保存不超过1周。

传代方法:沾取一环工作菌液培养物划线接种于改良MRS平板上，(36±1)℃厌氧培养(72±2)h，之后保存于2～5℃低温冰箱。测定前，用接种环小心挑取少量单菌落，接种于10 mL叶酸测定用培养基中，置于(36±1)℃培养箱中培养24 h。取出后放入4℃冰箱中储存，1周内用完。同时记录菌种代数，传代一般不超过5代。

1.2.2 样品测定液的制备 样品测定液制备参照国标要求进行。根据样品分类，固态和半固态样品分别进行粉碎、研磨、过筛，液态样品用前摇匀备用;

本文采用粗提手段快速确定样品中叶酸的含量范围。称取1 g样品到50 mL离心管中，用氢氧化钠乙醇溶液定容至40 mL，于121℃(0.10～0.12 MPa)高压灭菌15 min，取出后快速冷却至室温。在超净工作台内使用无菌过滤器过滤，得到样品工作液原液。使用无菌水对工作液原液进行10倍梯度稀释，得到一系列工作液稀释液。最高稀释度根据对样品含量的估计，自行选择。一般地，婴幼儿配方奶粉最高稀释度不宜超过300倍，维生素预混料稀释度范围在103～105倍，含量较低的天然食品稀释度不宜超过100倍。

1.2.3 标准曲线溶液的制备 参照国标要求，在超净工作台内使用无菌过滤器过滤标准工作溶液，相当于标准系列管中的叶酸含量分别为0.00、0.01、0.04、0.06、0.08、0.10 ng，备用。每隔一周应重复此步骤，将标准曲线数据与以前的数据对比，若同一标准点的吸光度值出现显著变化，应重新评估本法的检出限范围和线性范围。

1.2.4 接种和培养 在无菌操作条件下，向每个已灭菌的离心管内加入1.2.1制备的工作菌液培养物500μL，随后加入1.2.2制备的样品测定液稀释液作为测定组;在相同的条件下，加入1.2.3制备的标准工作液作为标准曲线组。两组同时在每管中加入400μL无菌蒸馏水，充分混匀。一个样品液或标准工作液重复3次。培养物总体积为1 mL。设置阴性对照，将样品测定液稀释液替换为不含叶酸的生物素溶液;设置空白对照，将样品测定液稀释液替换为无菌蒸馏水。将培养物置于(37±1)℃恒温培养箱中培养8～12 h。

1.2.5 叶酸含量的测定 将1.2.4中培养过的培养物用漩涡振荡仪混匀。按照标准工作溶液、待测试样、阴性对照、空白对照的顺序，向酶标板孔加入上述300μL培养物，同一管培养物做3个平行孔。在620 nm波长条件下读取各培养物的吸光度值。其中阴性对照、空白对照应无细菌生长，吸光度值应在0.1以下，否则可能混入不明来源叶酸或者接种菌液中含有残余叶酸;标准曲线、待测试样最高吸光度不宜超过1.0，否则应减少菌液接种量。

1.2.6 标准曲线的绘制 以标准工作溶液的叶酸含量为横坐标X，每个标准点的吸光度值为纵坐标Y，绘制标准曲线。标准曲线决定系数R2应大于0.98。得到的标准曲线方程为Y=4.590X+0.07360，R2=0.9904。

1.2.7 样品叶酸含量的计算 从标准曲线查得样品培养物中叶酸的相应含量(cx)，且各EP管之间查得的叶酸含量的偏差小于15%，则可按照式(1)进行结果计算;否则需重新取样测定。

式中，X:待测样品中叶酸含量，单位为微克每百克(μg/100 g);cx:从标准曲线上查得的菌悬液培养物离心管中叶酸含量，单位为纳克(ng);k1:由1.2.2制备的样品测定液工作液原液对应的1 g样品的定容体积，单位为mL;k2:由1.2.2制备的样品测定液工作液原液的稀释倍数。

1.2.8 方法检出限范围的确定 本方法检出限定义为:加菌培养物培养12 h后，菌悬液吸光度高于空白对照吸光度0.1的样品中叶酸的最低含量。该方法检出限与每次测试时的菌种状态、加菌量密切相关。因此，作为一种快速估算方法，已知样品稀释倍数的情况下，样品含量的下限范围可以根据式(2)检出限范围快速估算，且估算含量的准确度与方法检出限的范围大小密切相关。在本实验室中进行的重复试验证明，该方法检出限范围较小，精密度较高。

式中，X:待测样品中叶酸含量，单位为微克每百克(μg/100 g);cn:方法检出限，单位为微克每百克(μg/100 g);kmax:叶酸浓度高于检出限的最大稀释度。

1.2.9 方法线性范围的确定 本方法线性范围的定义为:加菌培养物在过夜(12 h以上)培养后，菌悬液吸光度与培养物中叶酸含量成线性相关的叶酸含量范围。同样地，该方法线性范围与测试时菌种状态，加菌量密切相关。同理，作为一种含量的快速估算方法，已知样品稀释倍数的情况下，样品含量的上限范围可以根据式(3)线性范围快速估算，且估算含量的准确度与方法区间的范围大小密切相关。

式中，X:待测样品中叶酸含量，单位为微克每百克(μg/100 g);k1:由1.2.2制备的样品测定液工作液原液对应的1 g样品的定容体积，单位为mL;kmin:叶酸浓度低于线性范围上限的最低稀释度。

1.2.10 方法回收率范围的确定 本方法回收率范围的定义为:样品待测液加菌培养物在过夜(12 h以上)培养后，选取多个时间点，取出该培养物分别测定吸光度值。根据(式1)计算出待测液叶酸含量并换算为叶酸添加量，与实际叶酸添加量的百分比。

2 结果与分析

2.1 方法的检出限范围

本实验室按1.2.1制备测试菌液，并选择一系列较低浓度的标准品进行了10次测试，每次测试记录下吸光度高于空白对照吸光度0.01以上的标准品浓度。将该浓度换算成样品含量，由低到高排列，得出在本实验室条件下，样品量为1 g，用氢氧化钠乙醇溶液定容至40 mL时，利用现制测试菌液进行测定，方法检出限范围为0.4～0.8μg/100 g。

2.2 方法的线性区间范围

在过夜培养(12 h以上)后，直到培养的第72 h，同一时间取出培养物读取吸光度值，同一批测试的线性区间不会随着时间的推移发生明显变化，但是菌悬液吸光度随时间增大。

本实验室按1.2.1制备测试菌液，并选择一系列浓度标准品进行了10次测试，每次测试记录下本方法线性范围，得出在本实验室条件下，利用现制测试菌液进行测定，方法线性范围为0.01～0.08 ng。

2.3 方法的回收率范围

经过实验室多次试验，该方法的回收率范围与测试时菌种状态，加菌量无显著关系。同一时间取出培养物读取吸光度值，同一批测试的回收率不会随着时间的推移发生明显变化，但是菌悬液吸光度随时间增大。本实验室按1.2.1制备测试菌液，分别添加10、40、80μg叶酸标准品，按式(1)推算待测液含量，分别进行6次测定，加标回收率测定结果如表1所示，得出本方法回收率范围为:82.1%～108.0%。

表1 加标回收率测定结果Table 1 Results of recovery test(n=6)

2.4 快速确定样品的含量范围

取市售婴幼儿配方乳粉、复合维生素预混料、叶酸含量不明的植物提取物样品，按1.2.2制备样品溶液，记录稀释倍数k1。随后将样品测定液10倍梯度稀释，作为待测液加入含菌培养液中，培养过夜(12 h以上)。随后取出，测定菌悬液吸光值。将稀释倍数的lg值为横坐标，菌悬液吸光度值为纵坐标，绘制散点图，结果如图2所示。

图2 3类典型样品测定结果Fig.2 Results of three typical samples注:A:复合维生素预混料测定结果。菌悬液吸光度均大于1.0，数据点无显著线性关系;B:植物提取物1样品测定结果。菌悬液吸光度均小于0.1，数据点无显著线性关系;C:婴幼儿配方乳粉样品测定结果。至少有一菌悬液吸光度位于0.1～1.0之间，且其中相邻两点或三点的趋势线与剩余各点的趋势线斜率有显著区别。

图A表示该样品经过稀释，最高稀释度待测液内叶酸含量大于0.08 ng，记录最高稀释倍数k2，因此该样品叶酸含量大于0.08×k1×k2;图B表示该样品经过稀释，最低稀释度待测液内叶酸含量小于0.01 ng，因此该样品叶酸含量小于0.01×k1;图C表示该样品经过稀释，有100倍稀释度叶酸含量位于0.01～0.08 ng之间。因此该样品叶酸含量范围为0.01×k1×100～0.08×k1×100。

样品叶酸含量范围可以通过两个方法验证得到。对于叶酸含量相对较低的样品，多次梯度稀释得到大于方法检出限叶酸含量的最大稀释度kmax，由式(2)得到叶酸含量下限;同理，叶酸含量相对较高的样品，多次梯度稀释得到小于方法线性范围上限叶酸含量的最小稀释度kmin，由式(3)得到叶酸含量上限。

2.5 估算样品的含量

若需估算样品含量，可以在确定样品含量范围后，将该样品稀释到kmin倍后，依次进行4次2倍梯度稀释，作为待测液加入含菌培养液中，另做两管标准品含菌培养液，分别添加0.01、0.08 ng叶酸标准品，同时培养过夜(12 h以上)。随后取出，测定菌悬液吸光度值。以叶酸含量为横坐标，菌悬液吸光度值为纵坐标，绘制两点连线。从两点连线确立的直线方程换算出待测液叶酸含量，再根据式(1)估算出样品含量。

本实验室选取了4类检测中遇到的叶酸含量未知的典型样品，分别进行6次测定，将本方法与国标检测结果进行对比，并分别取平均值和方差做t检验和F检验，结果见表2。

表2 国标检测方法与本方法的比较(n=6)Table 2 Comparison of GB 5009.211－2014 method and microbiological method(n=6)

由此可见，除婴幼儿配方奶粉外，本方法与国标法对其他样品的测定平均值没有显著差异(p＞0.05)，但两种方法平均值差值与算数平均值之比均小于11%。在较叶酸含量较高的复杂样品(植物提取物2)的测定中，本方法相比国标法出现了较大的变异系数(p＜0.0001)。但总体来说，本方法可以较好地预估样品叶酸含量范围，估算叶酸含量也与国标测定方法接近。尽管对部分样品的测定不如国标方法稳定，但不影响它作为快速检测方法提前预估样品叶酸含量范围的作用。为了更好地为国标法检测服务，叶酸含量较高的样品优先计算其含量上限，相对地，叶酸含量较低的样品优先计算其含量下限。得到对应的上或下限后，根据国标法的要求，称取相应的样品量，因此可以保证样品点均落在标准曲线范围内，得到更加准确的结果。

3 结论

本文提出了一种快速测定食品中叶酸含量范围的方法。该方法的检出限范围为0.4～0.8μg/100 g，线性范围为0.01～0.08 ng，回收率范围为82.1%～108.0%。相对于国标方法需要2～3 d时间测定，本方法只需1 d时间即可得到叶酸含量范围，能在较短时间提供样品叶酸含量范围，且步骤简洁，节约试剂材料。该方法可作为国标法测定叶酸含量的重要补充实验，适用于叶酸含量存疑样品的初步筛查或者数据确认。本文列举了在实验室内建立该检测方法的关键步骤，包括菌悬液制备、方法检出限确认、线性范围摸索和数据处理。使用本方法和国标GB 5009.211－2014方法同时对4种典型样品的叶酸含量进行测定，国标测定结果均落在本方法得到的叶酸含量范围内。文中提出的方法建立步骤可为同行业者借鉴，希望可以提供自主研发微生物法叶酸测定试剂盒理论依据和实践参考材料。