响应面优化超声波 微波协同提取凤眼莲黄酮工艺及其不同部位黄酮抗氧化活性分析

郭 莹，周 颖，毕海丹，白 雪，毛鸣杰，高 蕾，车 笑

(枣庄学院食品科学与制药工程学院，山东枣庄277160)

凤眼莲(Eichhornia crassipes)，俗称水葫芦，繁殖力极强，属雨久花科凤眼莲属的多年生漂浮水生草本植物，原产地南美洲［1］。在20世纪30年代初，凤眼莲作为畜禽饲料被引进至国内，逐渐发展成为水质净化及人们观赏的花卉植物，后逃逸为野生［2］。目前凤眼莲被列为十大恶草之一，主要作为废弃物、燃料、肥料或饲料［3－5］。目前对于凤眼莲的研究主要集中于利用凤眼莲治理河道或控制凤眼莲的恶性生长［6－8］，而对于其中生物活性物质如多糖、类黄酮、超氧化物歧化酶(SOD)及保幼激素类似物等还有待更深入的开发。

黄酮作为凤眼莲中主要活性成分之一［9］，关于其提取和抗氧化性已有初步研究。目前黄酮化合物的新型提取方法很多，有微波萃取法［10－11］、超声波法［12－13］、酶解法［14］、超临界萃取法［15］、半仿生提取法［16］等，还可以将上述方法联合使用进行提取，效果显著。超声波－微波协同提取技术是将超声波振动的空穴作用与开放式微波的高能作用两种方式相结合，具有快速、高效、不破坏分子结构、适宜热敏性和极性分子提取等优点［17］，非常适合黄酮类化合物的提取研究。曾俊美等［18］研究了超声波－微波协同法对龙眼壳中总黄酮提取率的影响，发现与超声或微波辅助提取法相比，该方法更省时，总黄酮提取率更高。俞坚［19］应用超声－微波协同萃取/反应仪研究了水芹叶总黄酮类化合物的工艺，发现其最优工艺条件为乙醇体积分数80%，液料比22∶1 mL/g，萃取功率563 W，萃取时间 4.2 min，此时，黄酮得率达44.7 mg/g。詹寿发等［20］利用超声波－微波协同提取葎草总黄酮，其最佳工艺中提取时间为22 min，黄酮得率为3.472%。目前关于凤眼黄酮提取的文章还较少，且对于其抗氧化能力也缺乏系统性的研究。

因此，本实验以凤眼莲为原料，采用超声波－微波协同提取凤眼莲黄酮，以黄酮得率为指标，以超声波功率、微波功率、料液比和提取时间为考察因素，通过响应面法优化提取工艺条件，并研究其不同部位的黄酮化合物的抗氧化活性，为凤眼莲的深度开发和综合利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

凤眼莲(Eichhornia crassipes) 6月份采于枣庄微山湖，60℃进行整株烘干以及分部位烘干，粉碎，过100目筛，避光保存，备用;芦丁标准品(＞98%) 中国药品生物制品检定所;无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、盐酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁、Tris、邻苯三酚 均为分析纯;1，1－二苯基－2－三硝基苯肼(1，1－diphenyl－2－picrylhydrazyl，DPPH) Sigma 公司。

WFZ－UV2000紫外可见分光光度计 尤尼柯仪器有限公司;XO－SM100微波－超声波组合联用仪 济南蓝迈仪器有限公司;FD－1A－50真空冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司;TGL－20A离心机 上海菲恰尔分析仪器有限公司;HH－4恒温水浴锅 上海跃进有限公司;PHS－3C精密酸度计 上海雷磁仪器厂;FA1104B电子天平 上海越平科学仪器有限公司;DFY－250高速万能粉碎机 广东佛山市方胜电器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 凤眼莲黄酮提取工艺 精确称取凤眼莲粉末样品，按照一定料液比加入60%乙醇，分别设置相应的微波功率、超声波功率和提取时间，于微波－超声波组合联用仪中进行提取，提取后真空抽滤，提取液备用。

1.2.2 单因素实验

1.2.2.1 超声波功率的选择 精确称取2 g凤眼莲粉末，60%乙醇作为提取溶剂，在料液比1∶20 g/mL，微波功率 400 W，超声波功率分别为 200、400、600、800、1000 W的条件下于微波－超声波组合联用仪中提取20 min，真空抽滤得黄酮提取液，测定不同超声波功率条件下凤眼莲黄酮得率。

1.2.2.2 微波功率的选择 精确称取2 g凤眼莲粉末，60%乙醇作为提取溶剂，在料液比1∶20 g/mL，超声波功率 600 W，微波功率分别为 300、350、400、450、500 W的条件下于微波－超声波组合联用仪中提取20 min，真空抽滤得黄酮提取液，测定不同微波功率条件下凤眼莲黄酮得率。

1.2.2.3 料液比的选择 精确称取2 g凤眼莲粉末，60%乙醇作为提取溶剂，料液比分别为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 g/mL，在超声波功率 600 W，微波功率400 W条件下于微波－超声波组合联用仪中提取20 min，真空抽滤得黄酮提取液，测定不同料液比条件下凤眼莲黄酮得率。

1.2.2.4 提取时间的选择 精确称取2 g凤眼莲粉末，60%乙醇作为提取溶剂，在料液比1∶20 g/mL，超声波功率600 W，微波功率为400 W的条件下于微波－超声波组合联用仪中分别提取 5、10、15、20、25、30 min，真空抽滤得黄酮提取液，测定不同提取时间条件下凤眼莲黄酮得率。

1.2.3 凤眼莲黄酮提取工艺的响应面优化 在单因素实验的基础上，以凤眼莲黄酮得率为响应值，以超声波功率(A)、微波功率(B)、料液比(C)和提取时间(D)四个因素为因变量，采用Box－Behnken设计方法对提取条件进行优化，实验因素及水平设计见表1。

表1 响应面实验设计因素水平编码Table 1 Factors and levels of response surface experimental design

1.2.4 凤眼莲黄酮得率的测定 将1.2.1制备的提取液用60%乙醇定容于100 mL容量瓶中。采用NaNO2－Al(NO3)3－NaOH显色法测定凤眼莲黄酮含量，制作芦丁标准曲线［21］，线性回归方程为 A=0.9737C+0.001，R2=0.9993。凤眼莲黄酮得率的计算公式如下:

式中，c为提取液黄酮的含量(mg/mL);V为提取液的体积(mL);m为凤眼莲粉末重量(mg)。

1.2.5 抗氧化活性的测定 以响应面实验优化的提取工艺参数为依据，分别对凤眼莲的根、茎、叶进行黄酮的提取、浓缩并真空冻干(温度:－45～－50℃，真空度:10～40 Pa)，以70%乙醇溶液分别配制成0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL 质量浓度梯度的样品溶液，以总还原能力、DPPH自由基清除率、超氧阴离子自由基清除率为评价指标进行凤眼莲黄酮抗氧化活性的分析。

1.2.5.1 总还原能力的测定 采用铁氰化钾还原法［22］。将2.5 mL的不同浓度梯度的样液(黄酮的质量浓度为0.1～0.8 mg/mL)与2.5 mL的磷酸盐缓冲液(p H6.6)混合，加入2.5 mL 1%铁氰化钾，50℃水浴中保温20 min，快速冷却，再加入2.5 mL 10%三氯乙酸，4000 r/min离心10 min，取上清液5 mL，向其中加5 mL去离子水，与1 mL 0.1%三氯化铁混合，充分振荡，静置10 min后于波长700 nm处测吸光值。取2.5 mL 70%乙醇溶液为空白对照液同以上操作参比调零，以吸光度表示总还原能力的大小。

1.2.5.2 DPPH自由基清除能力的测定 参照Oluwaseun等［10］的方法稍作修改，准确移取2 mL的90μmol/L DPPH的乙醇溶液，分别加入等体积样液(黄酮的质量浓度为0.1～0.8 mg/mL)于试管中，振荡摇匀，以2 mL的90μmol/L DPPH的乙醇溶液为空白对照，室温避光反应30 min后在517 nm波长条件下测其吸光度，以70%乙醇溶液参比调零。DPPH自由基清除率(Y)的计算公式如下:

式中，A0为空白对照的吸光值;A为样品的吸光值。

1.2.5.3 超氧阴离子自由基清除能力的测定 采用邻苯三酚自氧化法［23］。取 5 mL 50 mmol/LTris－HCl(pH8.2)缓冲液，置于20℃水浴中预热20 min，分别加入2 mL不同浓度梯度的样液(黄酮的质量浓度为0.1～0.8 mg/mL)，再加入1 mL 5 mmol/L的邻苯三酚溶液，混匀，在25℃水浴中反应5 min，最后加入1 mL 10 mol/LHCl终止反应，在320 nm处测定吸光度，对照组以蒸馏水代替邻苯三酚溶液，空白组以蒸馏水代替样液。超氧阴离子自由基清除率(Y)的计算公式如下:

式中，A为样品的吸光值;A1为对照组的吸光值;A0为空白组的吸光值。

1.3 数据统计分析

所有数据均为3次重复实验的平均值，单因素实验数据和抗氧化实验数据运用Sigma Plot 12.3软件绘制趋势曲线图，响应面实验采用Design－Expert V8.0.6软件进行数据处理及相关分析，并优化出最佳提取工艺。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 超声波功率对凤眼莲黄酮提取效果的影响由图1可知，超声波功率在200～600 W时，随着功率增加，凤眼莲黄酮得率也随之增大，这是因为随着超声波作用增强，超声波的机械作用和空化作用等效应增加了黄酮类化合物的溶出;当功率为600W时，得率达到最大，此时黄酮得率为3.53%;但超过600 W后，黄酮得率反而下降，可能是因为，空化泡增长过快或数量过多，导致超声波传播速度减慢并且不易崩解，降低黄酮溶出速度，而且超声波功率过高也使体系温度急剧升高，可能导致部分黄酮结构破坏［12］。所以超声波功率在600 W左右为宜。

图1 超声波功率对凤眼莲黄酮提取效果的影响Fig.1 Effect of ultrasonic power on the extraction efficiency of flavonoids from Eichhornia crassipes

2.1.2 微波功率对凤眼莲黄酮提取效果的影响 由图2可知，微波功率在300～400 W时，随着功率增加，凤眼莲黄酮得率也随之增大，原因可能是微波功率提高导致提取温度增高，高温增加了细胞壁的渗透性，也增加了黄酮的溶解度和扩散系数，溶剂的粘度也下降［24］，使黄酮类物质更易溶出;在微波功率为400W时，黄酮得率达到最大，此时得率为3.48%;而当微波功率超过400 W后，随着微波功率增大呈现下降趋势，原因可能是微波功率增加，在超声波的加持下，体系温度持续升高，造成部分黄酮类化合物的结构破坏［25］，并导致其他非黄酮类物质大量溶出。所以微波功率在400 W左右为宜。

图2 微波功率对凤眼莲黄酮提取效果的影响Fig.2 Effect of microwave power on the extraction efficiency of flavonoids from Eichhornia crassipes

2.1.3 料液比对凤眼莲黄酮提取效果的影响 由图3可知，料液比在1∶10～1∶20 g/mL 范围时，随着溶剂量的增加，凤眼莲黄酮得率也随之增大，这是因为增大了溶质推动力，有利于黄酮类物质的溶出，虽然凤眼莲黄酮得率明显提高，但提取液量过少不利于后期过滤工作，黄酮损失率也较大;当料液比在1∶20 g/mL时，黄酮得率达到最大，此时得率为3.49%;当料液比继续减少，凤眼莲黄酮得率降低，推断原因是溶剂量增多杂质成分溶出增多，影响了黄酮类物质的浸出，黄酮提取量很快达到溶解平衡［26］，且料液比过小也不利于后期浓缩，增加了浓缩时间。因此料液比在1∶20 g/mL左右为宜。

图3 料液比对凤眼莲黄酮提取效果的影响Fig.3 Effect of material－to－liquid ratios on the extraction efficiency of flavonoids from Eichhornia crassipes

2.1.4 提取时间对凤眼莲黄酮提取效果的影响 由图4可知，提取时间在5～20 min范围时，随着时间的延长，凤眼莲黄酮得率逐渐提高，这是由于超声－微波共同作用，各自优势体现较为明显，得率迅速增加;在提取时间为20 min时，黄酮得率达到最大，此时得率为3.47%;但随着时间延长，之后呈现下降趋势，原因可能是提取时间为20 min时大部分黄酮类物质已经溶出，时间继续增长，使部分黄酮降解并伴随着其他杂质的大量溶出［18］，导致得率降低。所以提取时间在20 min左右为宜。

图4 提取时间对凤眼莲黄酮提取效果的影响Fig.4 Effect of extraction time on the extraction efficiency of flavonoids from Eichhornia crassipes

2.2 响应面实验

2.2.1 响应面实验设计结果及方差分析 利用软件Design－Expert 8.0.6中的Box－Behnken模式设计响应面实验，依据表1的因素与水平值，每个实验组均进行多组平行实验，减少误差，实验结果见表2，方差分析结果见表3。

表3 响应面实验结果的方差分析Table 3 Analysis of variance for the regression model

表2 响应面实验设计与结果Table 2 Experimental design and corresponding results for response surface analysis

2 1 －1 0 0 3.12 3.18 3 －1 1 0 0 2.35 2.32 4 1 1 0 0 2.02 1.98 5 0 0 －1 －1 2.13 2.19 6 0 0 1 －1 2.25 2.28 7 0 0 －1 1 2.19 2.19 8 0 0 1 1 3.43 3.39 9 －1 0 0 －1 2.48 2.36 10 1 0 0 －1 2.19 2.11 11 －1 0 0 1 2.69 2.60 12 1 0 0 1 3.03 2.98 13 0 －1 －1 0 2.74 2.68 14 0 1 －1 0 1.81 1.76 15 0 －1 1 0 3.32 3.20 16 0 1 1 0 2.64 2.53 17 －1 0 －1 0 1.97 2.01 18 1 0 －1 0 2.52 2.53 19 －1 0 1 0 2.97 3.11 20 1 0 1 0 2.62 2.72 21 0 －1 0 －1 3.14 3.15 22 0 1 0 －1 1.12 1.22 23 0 －1 0 1 2.53 2.57 24 0 1 0 1 2.78 2.91 25 0 0 0 0 3.45 3.55 26 0 0 0 0 3.58 3.55 27 0 0 0 0 3.57 3.55 28 0 0 0 0 3.58 3.55 29 0 0 0 0 3.56 3.55

利用Design－Expert 8.0.6统计分析软件对表2的实验数据进行多元回归拟合分析，得到凤眼莲黄酮得率对编码自变量超声波功率(A)、微波功率(B)、料液比(C)和提取时间(D)的二次多项回归数学模型是:

Y=3.55+0.033A－0.40B+0.32C+0.28D－0.20AB－0.23AC+0.16AD+0.063BC+0.57BD+0.28CD－0.48A2－0.53B2－0.48C2－0.56D2。

对回归模型进行方差分析，结果见表3。该回归模型极显著(p＜0.0001)，失拟项不显著(p=0.0780＞0.05)，说明该回归模型与实验数据的拟合程度较高，实验误差小。另外表2响应值中黄酮得率与方程预测值的相关系数为0.9224，模型决定系数R2=0.9857，校正决定系数=0.9714，拟合状况良好，说明建立的回归模型可行。对回归方程系数进行显著性检验，各因素对凤眼莲黄酮得率影响排序为:微波功率(B)＞料液比(C)＞提取时间(D)＞超声波功率(A)。其中，影响极显著(p＜0.01)的是一次项B、C、D、交互项 BD，以及二次项 A2、B2、C2、D2，影响显著(p＜0.05)的是交互项 AB、AC、AD、CD，影响不显著的是一次项A和交互项BC。

2.2.2 响应面交互作用分析 等高线的性状可以反映各因素间交互作用的强弱关系，由图5可知，超声波功率和微波功率、超声波功率与料液比、超声波功率与提取时间、微波功率与提取时间、料液比与提取时间的等高线均成椭圆形，说明这5组因素之间的交互作用均较明显，但是微波功率与提取时间的交互作用比其他组的交互作用更加明显，这与表3的显著性分析一致。

图5 各因素交互作用对凤眼莲黄酮得率影响的响应面及等高线图Fig.5 Three－dimensional response surface and contour plots showing the interactive effects of various extraction parameters on the yield of flavonoids from Eichhornia crassipes

2.2.3 验证实验 应用响应面软件对回归模型进行分析得到最优提取条件为超声波功率606.81 W，微波功率388.06 W，料液比1∶21.9，提取时间21.14 min，最大黄酮得率预测值为3.69%。因仪器设备条件及操作方便等原因对相关参数条件进行调整，最优条件为超声波功率600 W，微波功率400 W，料液比1∶22，提取时间21 min，在此工艺条件下进行验证实验，得到凤眼莲黄酮得率为3.64% ±0.07%，与预测值相近，差异不显著(p＞0.05)，说明回归方程与实际情况拟合良好，充分验证了回归方程的可靠性。超声波－微波协同提取凤眼莲黄酮的得率明显高于黄映红等［27］通过超声波法提取凤眼莲黄酮的得率0.77%，说明超声波－微波协同提取凤眼莲黄酮效果较好。

2.3 凤眼莲不同部位黄酮类化合物抗氧化活性比较

以响应面实验优化的提取工艺参数为依据，分别对凤眼莲的根、茎、叶进行黄酮的提取，测定凤眼莲黄酮得率分别为凤眼莲根3.47% ±0.04%、凤眼莲叶3.62%±0.09%、凤眼莲茎3.38% ±0.03%。对不同部位的凤眼莲黄酮进行总还原能力、DPPH自由基清除能力、超氧阴离子自由基清除能力的测试，结果如图6所示。

由图6可知，当凤眼莲黄酮质量浓度在0.1～0.8 mg/mL范围时，不同部位提取的黄酮均具有抗氧化能力，且随着质量浓度的提高，均呈现能力增强的趋势，当处于同一质量浓度条件时，凤眼莲不同部位黄酮的总还原能力、DPPH自由基和超氧阴离子自由基的清除能力表现一致，依次为叶＞根＞茎。在黄酮质量浓度为0.8 mg/mL时，抗氧化能力最强，且三个指标的测试结果呈现较好的一致性。其中总还原能力(A700)测试中，叶的吸光值(1.18±0.01)＞根的吸光值(0.96±0.02)＞茎的吸光值(0.81±0.02);DPPH自由基的清除能力测试中，叶的DPPH自由基清除率61.25%±0.77%＞根的DPPH自由基清除率51.65%±0.69%＞茎的DPPH自由基清除率48.41%±0.69%;超氧阴离子自由基的清除能力测试中，叶的超氧阴离子自由基清除率75.90%±1.26%＞根的超氧阴离子自由基清除率(60.91±1.26)% ＞茎的超氧阴离子自由基清除率56.39%±0.80%。采用IBM SPSS Statistics 23进行分析，清除DPPH自由基和超氧阴离子自由基的 IC50分别为:凤眼莲叶0.569、0.389 mg/mL，凤眼莲根 0.754、0.555 mg/mL，凤眼莲茎 0.837、0.646 mg/mL。

图6 凤眼莲不同部位黄酮的总还原能力(a)、DPPH自由基的清除能力(b)和超氧阴离子自由基的清除能力(c)Fig.6 Total reduction ability(a)，DPPH free radical scavenging ability(b)and superoxide anion free radical scavenging ability(c)of flavonoids from the different parts of Eichhornia crassipes

3 结论

采用超声波－微波协同提取凤眼莲黄酮类化合物，利用Design－Expert 8.0.6软件对黄酮类化合物得率的二次回归模型进行设计分析，结果表明模型拟合程度较高，通过单因素及响应面实验优化确定凤眼莲黄酮最优提取条件为超声波功率600 W，微波功率400 W，料液比1∶22，提取时间21 min，在此工艺条件下得到凤眼莲黄酮得率为3.64% ±0.07%。通过此最佳工艺对凤眼莲不同部位黄酮进行提取，并进行体外抗氧化活性比较，评价指标为总还原能力、DPPH自由基和超氧阴离子自由基的清除能力，结果表明凤眼莲不同部位黄酮的三个抗氧化能力指标测试的结果具有一致性，抗氧化能力由高到低依次为叶、根和茎。清除DPPH自由基和超氧阴离子自由基的 IC50分别为:凤眼莲叶0.569、0.389 mg/mL，凤眼莲根0.754、0.555 mg/mL，凤眼莲茎 0.837、0.646 mg/mL。凤眼莲黄酮具有较好的抗氧化能力，可进一步的开发利用。