磷酸腺苷激活的蛋白激酶参与调节细胞外信号调节激酶1/2活化发挥对血管平滑肌细胞胰岛素样生长因子-1信号的抑制作用

宁钧宇 敬海明 杜宏举 齐丽娟 高 珊 李国君,3

(1.北京市疾病预防控制中心 北京市预防医学研究中心卫生毒理所，北京 100013； 2.北京市食物中毒诊断溯源技术重点实验室, 北京 100013； 3.首都医科大学公共卫生学院，北京 100069)

胰岛素样生长因子1(insulin like growth factor 1，IGF-1)是一种小分子多肽类生长因子，能够特异性结合细胞膜表面IGF-1受体，诱发酪氨酸位点磷酸化从而导致受体激活，并进一步活化下游信号如磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide 3 kinase，PI3K)和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)等通路，刺激多种正常和肿瘤细胞的生长、增生[1]。IGF-1信号通路的活性，在涉及血管平滑肌细胞增生的动脉粥样硬化及恶性肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用。

磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)是维护细胞内能量代谢平衡的关键 “传感器”及“效应器”：AMPK对细胞内AMP/ATP比例变化高度敏感，AMP/ATP比例升高导致AMPK活化，表现为α亚单位172位苏氨酸残基的磷酸化。活化的AMPK具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性，通过磷酸化特异性蛋白底物，将信号向下游传递，抑制合成代谢等耗能过程，促进分解代谢等产能过程[2-3]，从而使细胞内维持必要的ATP浓度满足生理需要。另外，AMPK参与包括IGF-1在内多种生长因子信号通路的调节，通过直接磷酸化结节性硬化蛋白2(tuberous sclerosis 2，TSC2)从而抑制生长因子激活的雷帕霉素靶蛋白1 (mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1)信号通路[4]。因此，AMPK被认为是沟通能量代谢和生长信号的关键性分子，能够对生长因子受体活化信号与细胞内营养状态起协调作用。

笔者曾经报道AMPK通过磷酸化胰岛素受体底物-1(insulin receptor substrate-1, IRS-1) 794位丝氨酸和TSC2 1 345位丝氨酸抑制IGF-1信号转导，从而抑制IGF-1刺激引起的血管平滑肌细胞增生及蛋白质合成，抑制AMPK活性导致IGF-1信号通路活化增强[5]。这里，笔者进一步发现，AMPK还能够通过抑制细胞内重要的增生信号分子细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal-regulated kinases 1/2，ERK1/2)的活化来抑制血管平滑肌细胞IGF-1信号通路。

1 材料与方法

1.1 试剂和抗体

二甲双胍购自美国Sigma公司；细胞培养试剂、转染试剂和抗生素购自美国Invitrogen公司；IGF-1购自天漠公司；抗体购自美国Cell Signaling 公司；化学发光试剂购自美国Thermal公司。

1.2 慢病毒载体构建

Lac Z病毒表达载体和两种带有HA标签蛋白的组成性激活型AMPK构建引物序列及病毒表达载体构建方法见参考文献[5]，所构建的两种组成性激活型AMPK分别为AMPK α亚单位氨基端312个氨基酸残基构成的截断体以及将该截断体第172位苏氨酸残基置换为门冬氨酸残基。敲低AMPK寡核苷酸序列及病毒载体构建方法见参考文献[5]。

1.3 慢病毒包装及细胞感染

用脂质体介导转染法包装慢病毒，详见参考文献[5]。

1.4 细胞培养及处理

血管平滑肌细胞原代分离培养自猪主动脉，方法参见Gockerman等[6]报道。细胞培养于葡萄糖浓度为5 mmol/L，含10%(体积分数)胎牛血清的DMEM培养基。传5至16代的原代培养细胞血清饥饿20 h后，加入3 mmol/L二甲双胍处理20 h，再加入20 ng/mL IGF-1作用10 min，弃培养基，收集细胞，提取蛋白，行免疫印迹检测蛋白质浓度。慢病毒感染细胞并获得稳定感染细胞系方法详见参考文献[5]，慢病毒感染细胞血清饥饿20 h后，加入20 ng/mL IGF-1作用10 min，收集细胞，免疫印迹检测蛋白质浓度。

1.5 细胞增生实验

各种细胞分别接种于六孔细胞培养板，培养基为含5 mmol/L葡萄糖、0.2%(体积分数)贫血小板血浆(platelet-poor plasma)的无血清DMEM。50 ng/mL IGF-1作用48 h后，细胞计数，计算各种细胞IGF-1刺激组与未加IGF-1组细胞数的比值，重复3次，计算均值并比较[7]。

1.6 蛋白质免疫印迹

收集不同处理细胞的总蛋白质，变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、转膜，一抗孵育，辣根过氧化物酶标记二抗孵育，化学发光法成像。详见参考文献[5]。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 AMPK抑制IGF-1刺激引起的ERK1/2活化

为了观察AMPK在IGF-1信号通路中的作用，采用AMPK激活剂二甲双胍处理血清饥饿的血管平滑肌细胞，并检测IGF-1刺激引起的ERK1/2活化状态。IGF-1的作用能明显降低血管平滑肌细胞AMPK 第172位苏氨酸的磷酸化，提示IGF-1的作用导致AMPK的活化受到抑制；同时，ERK1/2的磷酸化明显增高，表明IGF-1的作用导致ERK1/2信号活化。二甲双胍预处理16～18 h明显提高细胞内AMPK活性，在二甲双胍预处理条件下，IGF-1作用不能明显抑制AMPK活化。同时，与IGF-1单独作用相比，IGF-1与二甲双胍联合作用下，细胞内ERK1/2活性明显降低，提示AMPK活性能够抑制IGF-1刺激引起的血管平滑肌细胞ERK1/2活化，详见图1。

图1 AMPK抑制IGF-1刺激引起的ERK1/2活化Fig.1 Effect of AMPK inhibition on IGF-1-stimulated activation of ERK1/2

Porcinevascular smooth muscle cells(pSMC) were incubated in serum-free medium for 40 h. Metformin (Met) was added for the last 20 h at the concentration of 3 mmol/L followed by IGF-1 (20 ng/mL) for 10 min. The cell lysates were immunoblotted with anti-p-AMPK (T172), anti-AMPK, anti-p-ERK1/2(T202/Y204) and anti-ERK1/2 antibodies, respectively.p-AMPK：phospho-AMP-activated protein kinase；AMPK：AMP-activated protein kinase；p-ERK1/2：phospho-extracellular signal-regulated kinases 1/2；ERK1/2：extracellular signal-regulated kinases 1/2；IGF-1：insulin like growth factor-1.

2.2 组成性激活型AMPK抑制IGF-1刺激引起的ERK1/2活化及细胞增生

为了证实AMPK能够抑制IGF-1刺激引起的ERK1/2活化，构建了两种表达组成性激活型AMPK的慢病毒载体，AMPK(1～312)和AMPK(1～312)T172D,后者将前者第172位苏氨酸定点突变为天门冬氨酸(图2A)，并分别感染血管平滑肌细胞(图2B)，与作为对照的表达LacZ慢病毒感染细胞相比，两种组成性激活型AMPK过表达细胞中，IGF-1刺激引起的ERK1/2活化均受到明显抑制(图2C)。由于ERK1/2活化是促进细胞增生的重要信号，并在IGF-1刺激引起的细胞增生中发挥关键作用，检测了AMPK对IGF-1刺激引起的细胞增生的影响，结果显示，与表达LacZ慢病毒感染细胞相比，两种组成性激活型AMPK过表达的血管平滑肌细胞中，由IGF-1刺激引起的细胞增生均受到明显抑制(图2D)。提示AMPK活性能抑制由IGF-1刺激引起的血管平滑肌细胞增生，其抑制作用可能通过抑制细胞内ERK1/2活化来达成。

2.3 敲低AMPK增强IGF-1刺激引起的ERK1/2活化

为进一步证实AMPK活性能抑制细胞内ERK1/2活化，用降低细胞内AMPK表达的方法观察是否能增强IGF-1刺激引起的ERK1/2活化。构建了3种敲低AMPK的慢病毒载体：Si-AMPK1、2、3，并分别感染血管平滑肌细胞，结果显示，3种病毒感染均能明显降低细胞内AMPK表达水平(图3A)。选用降低AMPK表达效率最高的Si-AMPK3病毒感染做进一步实验，结果显示，与空载体包装的病毒感染相比， 降低AMPK表达能明显增强IGF-1刺激引起的血管平滑肌细胞ERK1/2活化，这进一步证明AMPK活性能抑制ERK1/2活化(图3B)。

3 讨论

随着社会经济的发展和人们生活水平的提高，与环境因素、生活方式及人口老龄化密切相关的慢性非传染性疾病动脉粥样硬化的发病率逐渐上升。动脉粥样硬化的发病过程中，在脂质代谢异常、血管内皮损伤等多因素协同下，血管平滑肌细胞的表型转化发挥了重要作用。血管平滑肌细胞由合成能力强、增生能力弱的分化型向合成能力弱、增生能力强的去分化型的表型转化，并发生细胞增生和迁移是动脉粥样硬化的特征性病变[8-9]，因此，研究血管平滑肌细胞表型转化的分子机制，对于充分认识动脉粥样硬化的发生发展规律，从而提出有效防治措施具有重要意义。

动脉粥样硬化中血管平滑肌细胞的病理性改变受到包括IGF-1在内的多种生长因子的调控[1]，IGF-1刺激引起的AKT信号通路活化对于促进细胞增生、运动发挥重要作用，本课题组前期报道了AMPK通过直接磷酸化IRS-1 第794位丝氨酸引起PI3K活性抑制，进而抑制AKT活化，从而对血管平滑肌细胞中IGF-1信号通路起负性调控作用[5]。IGF-1刺激除了能引起AKT活化外，还能引起ERK1/2的活化[10]。AMPK对血管平滑肌细胞ERK1/2活性的影响以及AMPK是否能够通过抑制ERK1/2活化发挥对血管平滑肌细胞IGF-1信号通路的负性调控作用，国内外报道较少。本研究中，本课题组通过使用AMPK激活剂二甲双胍处理、组成性激活型AMPK慢病毒感染及敲低AMPK慢病毒感染等方法，证明AMPK活化能够导致血管平滑肌细胞IGF-1刺激引起的ERK1/2活性降低，并进而抑制细胞增生。

图2 组成性激活型AMPK抑制IGF-1刺激引起的ERK1/2活化及细胞增生Fig.2 Constitutively active AMPK suppresses ERK1/2 activation and cells proliferation stimulated by IGF-1

图3 敲低AMPK增强IGF-1刺激引起的ERK1/2活化Fig.3 Knock-down of AMPK enhances ERK1/2 activation stimulated by IGF-1

A:Porcinevascular smooth muscle cells (pSMC) were transduced with empty vector (Si-EVT) or three different AMPK short hairpin RNA templates(Si-AMPK 1,2,3). The cells were analyzed for AMPK protein expression. The cell lysates were immunoblotted with an anti-AMPK or an anti-β-actin antibody.B:Porcinevascular smooth muscle cells (pSMC) transduced with Si-EVT or Si-AMPK was incubated in serum-free medium for 20 h followed by IGF-1 (20 ng/mL) for 10 min. The cell lysates were immunoblotted with antibodies indicated, respectively.AMPK：AMP-activated protein kinase；IGF-1：insulin like growth factor-1；ERK1/2：extracellular signal-regulated kinases 1/2;p-ERK1/2：phospho-extracellular signal-regulated kinases 1/2.

AMPK活化对动脉粥样硬化的发生发展有明显抑制作用，其机制涉及多个方面，有文献[11]报道AMPK通过抑制氧化应激过程来抑制动脉粥样硬化的发生，抑制血管内皮细胞AMPK活性明显增强软脂酸盐诱导的氧化应激(oxidation stress)；与ApoE基因敲除小鼠相比，AMPKα2与ApoE联合基因敲除小鼠血清三酰甘油浓度明显增加，动脉粥样硬化病灶面积明显增大。进一步的研究[12]显示，AMPKα2通过维持肌浆网钙泵(sarcoendoplasmic reticulum calcium ATPase， SERCA)活性来保持细胞内Ca2+动态平衡，从而抑制内质网应激，并认为AMPKα2通过此种机制抑制动脉粥样硬化的发生。Vasamsetti等[13]的研究提示，AMPK还能通过STAT3通路抑制单核细胞向巨噬细胞的分化，从而抑制动脉粥样硬化的发生发展。因此，AMPK对动脉粥样硬化的抑制是多种途径共同作用的结果[14]。本研究提示AMPK抑制生长因子信号活性，从而抑制血管平滑肌细胞的增生；另外,AMPK对生长因子信号的抑制，可作用于生长因子及其受体下游多条信号通路，为AMPK抑制动脉粥样硬化提供新的理论依据。