硫酸铜和纳米铜对鸡胚代谢和发育的影响

郭永清，张小宇，陈玉洁，王 勇，杨 凤

（1.内蒙古农业大学职业技术学院，内蒙古包头 014109；2.内蒙古农业大学，内蒙古呼和浩特 010018）

铜是酶- 辅酶催化反应、氧转运和血红蛋白合成等生化过程所需的微量矿物质元素（Kim 等，2008），同时它用于家禽具有促生长和抗病作用（Richards 等，2010）。家禽养殖中，铜常作为替代抗生素的首选微量元素，对家禽生长性能的影响可以达到与抗生素一致的效果。理论上，日粮添加越多的铜其促生长效果越好，但实际日粮铜水平升高会导致家禽和猪的消化率降低，过多的铜经粪便排出，对环境造成污染（Zhao 等，2010）。有学者认为，无机铜较有机铜或纳米铜的生物学效率低，但关于有机铜对家禽生长或免疫方面的研究结果存在差异（Creech 等，2004），还有待进一步探讨。鸡整个生命周期中有近40% 的时间是在胚胎中度过，因此，胚胎发生期是鸡生长过程中最关键的时期（Azaranova 等，2012）。Yair 和Uni（2011）认为胚胎在孵化的最后几天，蛋黄中铜含量低会导致胚胎缺乏矿物质，在此期间，胚胎可利用的铜较少；因此，体外给胚胎提高铜理论上可以提高鸡蛋的孵化性能和仔鸡生长性能。有研究表明，给鸡胚体外注射纳米铜较硫酸铜更能渗透进入胚胎组织，从而可以提高生长性能，同时体外注射纳米铜也对胚胎无毒害作用，对出生仔鸡的死亡率也无显著影响（Joshua 等，2016）。纳米铜可以在细胞和核膜之间移动，穿透细胞和细胞内结构，移动到体内指定的目标点。有研究表明，50 mg/kg 纳米铜可以在分子和系统水平上增强胚胎血管敏感性，因此，本试验通过体外注射纳米铜和硫酸铜，研究其对鸡胚代谢的影响，其中耗氧量和能量消耗量是重点考察指标，它们是评估胚胎代谢率的重要指标（Tona 等，2004）。

1 材料与方法

1.1 试验设计 试验选择240 枚SPF 受精蛋，随机分为6 组，每组4 个重复，每个重复10 枚鸡蛋。鸡蛋入孵当天对照组不做任何处理，阴性对照组注射0.25 mL 去离子水，硫酸铜组分别注射0.25、50 和100 mg/kg 硫酸铜，纳米铜组分别注射0.25、50 和100 mg/kg 纳 米 铜（5 ～10 nm，99% 纯 度，购自四川吉隆达集团），即每个鸡蛋注射12.5 或25 μg 硫酸铜或纳米铜。受精蛋注射硫酸铜或纳米铜后，将蛋放入孵化箱孵化21 d，其中1 ～18 d 孵化温度为37.8℃，相对湿度为60%，每天翻蛋1 次；19 ～21 d 孵化温度为37℃，相对湿度为70%。

1.2 胚胎代谢 分别在孵化的第12、14、16 和18天进行代谢测定，具体测定方法参考Chwalibog等（2007）的方法，其中氧耗量通过氧交换机进行测定，由于鸡蛋重量存在差异，因此，统一化成50 g鸡蛋的耗氧量。计算公式如下：

1.3 血液指标及组织器官重量 在孵化结束当天，每个重复随机选择5 只鸡称重后采血，颈部处死。血液离心后分离血清，用试剂盒法测定血清白蛋白、碱性磷酸酶、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、乳酸脱氢酶、胆固醇、肌酸苷、甘油三酯、磷酸盐、尿素氮和葡萄糖含量（试剂盒购自南京建成生物工程研究所）。仔鸡出壳后称量卵黄囊重，分离屠宰鸡的心脏、肝脏、小肠和胸肌，称其重量

1.4 基因表达 将肝脏组织和胸肌组织在液氮条件下磨碎，用Trizol 法提取总RNA，参考Sawosz 等（2012）的研究方法，其中肝脏组织分析核因子和肿瘤坏死因子α 基因的相对表达量，胸肌组织分析血管内皮生长因子A 和成纤维细胞生长因子2 基因的相对表达量。荧光定量PCR 结果均以β-actin 基因作为内参。

1.5 统计分析 试验数据采用SAS 一般线性模型进行分析，用Ducan’s 法进行多重比较。其中耗氧量和能量消耗量的差异采用LSD 法，具体模型为Yij=u+ai+bj+（ab）ij+eij，其中u 表示试验数据平均值，ai表示各处理组效应，bj表示孵化天数，（ab）ij表示组别和日龄的交互效应，eij表示残差。以P ＜0.05 作为差异显著。

2 结果与分析

2.1 鸡胚注射不同水平硫酸铜和纳米铜对鸡胚代谢速度的影响 由表1 可知，与对照组和阴性对照组相比，鸡胚注射硫酸铜和纳米铜提高了鸡胚耗氧量。鸡胚注射50 mg/kg 纳米铜较其他组显著提高了16 和18 d 鸡胚耗氧量（P ＜0.05），而100 mg/kg 硫酸铜较50 mg/kg 硫酸铜组显著提高了12 和14 d 鸡胚耗氧量（P ＜0.05），同时100 mg/kg 纳米铜较50 mg/kg 纳米铜显著提高了各日龄鸡胚的耗氧量（P ＜0.05）。鸡胚注射硫酸铜或纳米铜对鸡胚孵化全期耗氧量无显著影响（P ＞0.05）。

表1 硫酸铜和纳米铜对鸡胚耗氧量的影响 mL/h

鸡胚注射不同水平硫酸铜和纳米铜对鸡胚能量消耗量的影响见表2，鸡胚注射硫酸铜或纳米铜较对照组和阴性对照组显著提高了各日龄鸡胚能量消耗（P ＜0.05）。除了18 d 鸡胚外，100 mg/kg 硫酸铜较50 mg/kg 硫酸铜均显著提高了鸡胚能量消耗（P ＜0.05）。50 mg/kg 纳米铜较100 mg/kg 纳米铜显著提高了12 d 鸡胚能量消耗（P ＜0.05），但在后期各阶段均显著低于100 mg/kg 纳米铜（P ＜0.05）。鸡胚注射硫酸铜或纳米铜对鸡胚孵化全期能量消耗无显著影响（P ＞0.05）。

表2 硫酸铜和纳米铜对鸡胚能量消耗的影响

2.2 鸡胚注射不同水平硫酸铜和纳米铜对血液生化指标的影响 由表3 可知，各组对鸡胚血液生化指标的影响无显著差异（P ＞0.05）。但纳米铜组较对照组、阴性对照组和硫酸铜组有降低鸡胚血液胆固醇和甘油三酯含量的趋势（P=0.07）。

2.3 鸡胚注射不同水平硫酸铜和纳米铜对鸡胚组织器官相对重量的影响 由表4 可知，与对照组和阴性对照组相比，鸡胚注射纳米铜或硫酸铜对鸡胚蛋黄、心脏、肝脏、小肠和胸肌重量的影响均无显著差异（P ＞0.05）。鸡胚注射硫酸铜、纳米铜或去离子水较对照组显著提高了卵黄囊重量（P ＜0.05），纳米铜组和阴性对照组较硫酸铜组显著提高了卵黄囊重量（P ＜0.05），和100 mg/kg纳米铜组相比，50 mg/kg 纳米铜卵黄囊重量显著提高4.3%（P ＜0.05），而50 和100 mg/kg 硫酸铜对鸡胚卵黄囊重量的影响无显著差异（P ＞0.05）。

表3 硫酸铜和纳米铜对鸡胚血液生化指标的影响

表4 硫酸铜和纳米铜对鸡胚组织器官重量的影响 g

2.4 鸡胚注射不同水平硫酸铜和纳米铜对鸡胚发育相关基因表达的影响 由表5 可知，与对照组和阴性对照组相比，鸡胚注射纳米铜或硫酸铜对鸡胚核因子、肿瘤坏死因子α 和血管内皮生长因子A 基因的mRNA 相对表达水平均无显著影响（P ＞0.05）。但100 mg/kg 硫酸铜组较其他各组显著提高了成纤维细胞生长因子2 基因的mRNA 相对表达水平（P ＜0.05）。

3 讨论

铜经过纳米级处理后对动物生长性能影响的机制还尚不清楚，有研究认为，纳米铜可以提高机体的抗菌能力，但也有报道指出，纳米铜主要是通过改善机体对能量和脂肪的消化率来影响生长 性 能（Usman 等，2013）。Pineda 等（2012）研究发现，纳米级的银离子可以运输氧气，而纳米铜是输氧蛋白的主要成分，因此，作者假设鸡胚体外注射纳米铜可以提高氧气的利用率。铜是血红蛋白的重要组成部分，负责细胞氧气的运输和一些重要酶如细胞色素c 氧化酶的活力，后者对细胞能量代谢极为重要。本试验研究了体外注射纳米铜或硫酸铜对鸡胚耗氧量和能量消耗量的影响。结果发现，鸡胚注射硫酸铜或纳米铜较对照组和阴性对照组显著提高了各日龄鸡胚能量消耗，且纳米铜的效果更为显著，这与纳米铜较硫酸铜的生物学利用率高，对血管形成和生长的作用高于硫酸铜有关（Mroczek-Sosnowska 等，2015）。此外，纳米铜由于颗粒粒度小，具有较高的表面积，因此具有特殊的物理化学活性和较强的穿透能力（Mamonova 等，2013）。

表5 硫酸铜和纳米铜对鸡胚发育相关基因表达的影响

试验用卵黄囊和组织器官的重量评估胚胎的发育状况，但结果发现，鸡胚注射硫酸铜、纳米铜或去离子水较对照组显著提高卵黄囊重量，但对其他组织器官的重量无显著影响，这说明硫酸铜或纳米铜对鸡胚代谢率的影响还未达到影响鸡胚生长发育的程度。50 mg/kg 纳米铜提高了鸡胚代谢率，这与Pineda 等（2012）的研究报道存在差异，这与不同品种的鸡胚重量不同有关，蛋鸡鸡胚重量小于肉鸡，代谢速度慢。肉鸡生长快速，其蛋黄较大，需要更多的能量用于生长（Buzala 等，2015）。

本试验结果发现，体外注射硫酸铜或纳米铜对血清生化指标无显著影响，纳米铜较硫酸铜有降低甘油三酯和胆固醇的趋势，说明鸡胚孵化前注射硫酸铜对鸡胚孵化性能无显著影响Mroczek-Sosnowska 等（2015）。鸡胚注射硫酸铜或纳米铜对肝脏免疫相关基因（核因子和肿瘤坏死因子）及胸肌生长相关基因（血管内皮生长因子A）的mRNA 相对表达量无显著影响，但100 mg/kg硫酸铜组较其他各组显著提高了成纤维细胞生长因子2 基因的mRNA 相对表达水平，其原因可能是抗原呈递细胞没有在孵化的幼体中吸收纳米铜离子，并且免疫刺激功能还不完善，同时Pineda等（2012）的研究结果也显示鸡胚注射50 mg/kg纳米铜对抗炎因子也无显著影响。

4 结论

鸡胚体外注射50 mg/kg 纳米铜可以促进胚胎代谢速度，纳米铜对鸡胚具有免疫生物学相容性，对鸡胚孵化无负面影响。