甘草渣中木质素及综纤维素复合酶降解工艺的研究

李婷婷，李 鑫，2，王 婷，李 萌，马玉萍，童延斌，刘明亮

（1.石河子大学生命科学学院，新疆石河子 832000；2.新疆植物药资源利用教育部重点试验室，新疆石河子 832000；3.石河子大学化学化工学院，新疆石河子 832000）

甘草是传统中药材之一，有“众药之王”“十方九草”美誉之称（罗燕燕等，2017）。甘草渣是在提取甘草浸膏、甘草酸等产品后的残渣，目前在新疆地区尚未得到合理的开发利用（Luo 等，2017）。研究表明，甘草废渣里含有多糖、黄酮类、生物碱、甘草酸、氨基酸、甾体、三萜类、有机酸、香豆素、萜类内酯等化合物（袁茹楠，2017），以及Sr、Fe、Zn、Mn 等无机成分，这些营养物质具有增强机体免疫功能、抗肿瘤、抗溃疡和抗氧化等作用（Xie 等，2017），故甘草渣也被视为宝贵的可再利用植物资源（Kooravand 等，2017）。若能将其转化为动物饲料，对牲畜生产性能、体质和增强免疫力具有很好的促进效果。当前，许多畜牧业发展较快的国家和地区都对抗生素类饲料添加剂进行了严格监管。我国相关食品监管部门也开始重视畜禽养殖使用的抗生素，并不断探索寻求更加安全、环保的饲料添加剂，以此来为畜产品提供安全保障。与抗生素饲料添加剂相比，天然植物所富含的营养成分副作用少，能提高动物饲料的品质，从而有效提高养殖效益。将甘草渣转化为动物饲料，不仅能降低环境污染和资源浪费，更重要的是能提升动物饲料品质，提高动物饲料的安全性，为畜牧产业带来诸多好处（李丽萍，2016）。

甘草渣中木质素和综纤维素含量较高，其中综纤维素包括纤维素和半纤维素（黄安民等，2007）。动物本身对木质素和综纤维素几乎不能消化吸收（Sharma 等，2010），只是依赖于其消化道内的微生物来实现降解，若木质素和综纤维素在饲粮中占有较高比例，会对干物质采食量产生负面影响（Yang，2012），导致动物热增耗增加和饲料利用率下降（张崇玉等，2014）。研究表明：饲粮粗纤维每提高1%，能量消化率下降1.13%，代谢能（ME）利用率下降0.19%，饲料转化率下降3%（Kohlstedt 等，2018）。因此，甘草渣中存在大量难以降解的木质素和综纤维素严重阻碍了其饲料转化。

目前针对动物饲料中木质素和综纤维素的降解方法主要有复合酶处理法（李晓等，2016）、化学法（张素文，2016）和微生物处理法（孟婧，2016）三大类。复合酶处理法具有高效、绿色环保等优点，适用于甘草渣的工业化处理，且相关研究未见报道。试验以新疆地产甘草渣为原料，采用复合酶处理法，在多糖和黄酮含量没有明显减少的前提下，以木质素和综纤维素的降解率为衡量指标，通过正交试验对甘草渣中的木质素和纤维素的降解工艺进行研究。

1 材料与方法

1.1 试验材料、仪器和试剂 乌拉尔甘草渣由新疆阿拉尔新农甘草公司提供。

复合酶（由含 22000 VISCO 单位/g 木聚糖酶和2 000 AGL 单位/g β-葡聚糖酶、纤维素酶、果胶酶等19 种酶组合在一起的复合酶制剂），购于北京安瑞博特生物技术有限公司。

无水乙醇、亚硝酸钠、氢氧化钠、硝酸钠、苯酚、浓硫酸、浓盐酸均为市售分析纯。

恒温箱（DC-1006，上海平轩科学仪器有限公司制造）；分光光度计（沪制01030007 号，上海棱光技术有限公司制造）；离心机（上海安亭科学仪器厂，TDL-5-A）；高压灭菌锅（LDZX-50FBS，上海申安医疗器械厂）。

1.2 试验方法

1.2.1 木质素、综纤维素、多糖和黄酮含量测定 根据李华等（2007）的方法测定甘草渣中木质素、综纤维素的含量，利用硝酸铝法测定黄酮含量。利用苯酚- 硫酸法（Jun 等，2016）测定多糖含量。

1.2.2 数据分析方法 试验数据均以“平均数± 标准差”表示，采用SPSS 15.0 软件进行统计分析，所有数据均设置了3 组重复，对方差进行Duncan’s 法多重比较，P ＜0.05 表示差异显著。

1.2.3 不同单因素对甘草渣中木质素和综纤维素效率的影响 精密称取10 g 灭菌后的甘草渣样品，置于玻璃培养瓶中，在121℃下灭菌20 min。依次进行pH、酶解温度、酶解时间、复合酶用量的单因素试验，其中每个因素包含6 个试验水平（见表1 ～4）并设置3 次平行试验。试验方法：取一定量复合酶溶解于不同pH 的1 mol/L 柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，于超净工作台中按照酶用量向甘草渣加入对应体积的酶液，将培养瓶密封后置于不同温度下的恒温箱中进行处理。达到反应时间后迅速将酶液与样品分离，按照1.2.1 中的方法分别检测木质素、综纤维素的含量。对照组将酶液换成等体积的柠檬酸—柠檬酸钠缓冲液，其他因素与试验组相同。单因素试验结束后，按以下公式计算各组样品中的木质素、综纤维素降解率

木质素（纤维素或半纤维素）降解率/%=[（对照组总质量- 试验组总质量）/ 对照组总质量]×100。

在查阅相关文献和本试验所用复合酶的说明书后，推算复合酶用量90 mg/g，pH 为5.0，酶解温度为40℃，酶解时间为18 h 可能为反应的适宜条件，故将其设置为恒定因素。

表1 单因素试验指标 - 复合酶用量

表2 单因素试验指标-pH

表3 单因素试验指标- 酶解温度

表4 单因素试验指标 - 处理时间

1.2.4 多因素正交试验 根据单因素试验结果，以木质素和综纤维素降解率为评价指标，按照L9（34）表头设计正交试验，每组设置3 个平行样品。经处理后的甘草渣，以1.2.1 的试验方法测定木质素、纤维素和半纤维素的降解率，并计算多糖和黄酮的增量水平。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 不同pH 对木质素、综纤维素降解率的影响 从表5 中可以看出，随着pH 的升高，木质素、纤维素、半纤维素的降解率均呈现升高趋势，在pH=6.5 时，木质素的降解率为19.907%，相较于pH=6 时的降解率稍有下降。

表5 不同pH 对木质素、综纤维素降解率的影响

2.1.2 不同酶解温度对木质素、综纤维素降解率的影响 从表6 中可以看出，木质素、纤维素及半纤维素的降解率随温度升高呈先增大后减小的趋势，在45℃时，木质素降解率达到最大值19.997%，在50℃时，纤维素及半纤维素均达到最大降解率，分别为45.273% 和63.924%。

表 6 不同酶解温度对木质素、综纤维素降解率的影响

2.1.3 不同酶解时间对木质素、综纤维素降解率的影响 从表7 可以看出，木质素、纤维素及半纤维素的降解率均随处理时间的增加而升高，在22 h 时降解率均达到最大值，分别为20.411%、45.718%、64.198%。

表7 不同酶解时间对木质素、综纤维素降解率的影响

2.1.4 不同复合酶用量对木质素、综纤维素降解率的影响 从表8 可以看出，随着复合酶用量的增加，木质素、纤维素及半纤维素的降解率也随之增大，在复合酶用量为130 mg/g 时达到最大，分别为20.353%、46.600%、64.492%。

表8 不同复合酶用量对木质素、综纤维素降解率的影响

2.2 正交试验 依据单因素试验结果，设置3 组不同水平的pH、处理时间、酶解温度、酶用量进行正交试验，结果见表9。

表9 正交试验结果

从表9 可以看出，在pH 为6.0，酶解温度为45 ℃，酶解时间为16 h，复合酶用量为110 mg/g 的条件下，木质素降解率可达20.340%，纤维素降解率可达46.303%，半纤维素降解率可达65.011%。此条件下木质素及综纤维素降解率均为最高值，故可选择该条件作为最优降解条件。

2.3 黄酮与多糖含量的变化 从表10 中可以看出，经过复合酶处理后的甘草渣中黄酮和多糖的含量显著增加，其中黄酮增加了219.62%，多糖增加了1780.51%。

表10 黄酮与多糖含量的变化

3 讨论

从表中利用正交极差法得出的R 值可以看出，各试验因素对木质素降解率的影响表现为：pH ＞处理时间＞复合酶用量＞酶解温度；各试验因素对纤维素降解率的影响表现为：pH ＞处理时间＞复合酶用量＞酶解温度；各试验因素对半纤维素降解率的影响表现为：pH ＞酶解温度＞处理时间＞复合酶用量。结果显示，pH 对复合酶降解甘草渣中木质素及综纤维素影响显著，是主要影响因素，其次为处理时间。

黄爱玲（2005）研究表明，pH 高低不仅可以影响酶活力，并且可以在一定程度上影响酶的稳定性，当pH 超过一定的范围会导致酶的不可逆变性。同时，pH 过高或过低会改变酶解离状态，影响酶与底物的结合。因此，使用复合酶处理法降解甘草渣，控制pH 尤其重要。甘草渣中木质素及综纤维素含量较高，木质素作为外衣保护着纤维素和半纤维素免受酶的降解（张璐，2016）。故酶解效果受到酶解时间的限制，处理时间越长，酶解效果越好。但考虑到生产时的成本问题，选择酶解16 h 作为最佳处理时间，既能使木质素及综纤维素得到有效降解，还能降低生产成本。

在已知报道中，复合酶处理法主要采用漆酶、纤维素酶、果胶酶等，通过一定比例混合后在常温下对植物材料进行处理，以高效降解其中木质素、纤维素和半纤维素，常见于秸秆和农副产品的饲料初加工过程（张强等，2009）。本试验中木质素的降解率与王健等（2017）以毛竹为试验材料，采用纤维素酶解法得到降解率基本相同，其最佳反应条件为：酶解反应时，控制酶/ 底物比1 ∶8，底物浓度为0.025 g/mL，反应温度50℃下反应48 h。可以看出，采用复合酶法降解木质素及综纤维素效率更高。纤维素的降解率与刘朝龙等（2012）利用纤维素酶对花生壳进行酶解的降解率相比较低，其测得最佳酶解条件下纤维素降解率为63.61%，可能是因为试验材料和使用酶的不同导致了一定的差异。

由此可知，用复合酶降解甘草渣中的木质素及综纤维素效率较高。用复合酶处理甘草渣可以使甘草渣中的有效成分被释放出来，纤维素酶还可以将纤维素降解为单糖，有利于动物吸收。

4 结论

本研究通过单因素和正交试验筛选出适用于复合酶降解甘草渣中木质素及综纤维素的最佳工艺条件为复合酶用量110 mg/g，pH 6.0，酶解温度45℃，酶解时间16 h。在此条件下，木质素降解率可达20.340%，纤维素降解率可达46.303%，半纤维素降解率可达65.011%。同时，处理后的甘草渣中黄酮和多糖的含量显著增加，黄酮含量增加了219.62%，多糖含量增加了1780.51%。研究为甘草渣饲料化提供了理论依据。