c-Jun蛋白对A型流感病毒H1N1感染小鼠体内CD4＋和CD8＋T细胞增殖的调节作用

张守平，申汶涛，王丽荣，张百重3*

（1.河南科技学院动物科技学院，河南新乡453003；2.中国农业大学动物医学院，北京100192；3.河南科技学院资源与环境学院，河南新乡453003）

A型流感病毒是引发流感的重要病原，可以感染多种动物，引起发热、咳嗽、呼吸困难等呼吸系统疾病以致全身严重败血症等多种症状。经A型流感病毒感染后的复杂致病机制一直是科学家们研究的热点。杀伤性T细胞（CD8+T细胞）在病毒的清除中发挥重要作用，其作用方式为直接裂解被感染细胞或释放γ-干扰素（interferon-γ,IFN-γ）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor,TNF-α）等促炎性细胞因子，有效控制流感病毒感染。CD8+T缺乏的小鼠感染流感病毒后呈现出更高的易感性和病毒复制量[1]。辅助性T细胞（CD4+T细胞）通过分泌IFN-γ、白介素-2（interleukin-2,IL-2）和TNF-α等来促进B细胞产生抗体和维持CD8+T细胞功能，而缺乏CD4+T细胞的小鼠呈现出流感病毒清除延迟的现象[2]。因此，CD4+T和CD8+T细胞在抗流感感染免疫中发挥着重要的作用。

c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase,JNK）信号通路对CD4+和CD8+T细胞的增殖、分化等过程具有重要的调控作用[3]。c-Jun是一种原癌蛋白，也是JNK通路发挥作用的一种下游转录因子。在流感病毒感染的早期，可以检测到c-Jun活化蛋白，而其在流感病毒感染过程中是否对CD4+和CD8+T细胞发挥作用还不清楚。核酶Dz13是一种可以特异性切割并降解c-Jun蛋白的DNA分子，即一种脱氧核酶，目前已经很成熟地应用在抗肿瘤、细胞迁移等方面的研究中。有研究显示，使用Dz13阻断c-Jun蛋白可以在体外抑制单核-内皮细胞聚集，在大鼠炎症模型中阻止白细胞黏附、渗出[4]。但是关于Dz13应用于病毒感染所引起的细胞增殖或分化等的报道则很少。在本研究中，通过建立H1N1流感病毒感染模型，使用Dz13抑制c-Jun蛋白的表达，从而探讨c-Jun蛋白对病毒感染后小鼠体内CD4+和CD8+T细胞的增殖及细胞因子的调节作用。

1 材料与方法

1.1 材料

动物：6～8周龄无特定病原体（specific pathogen free,SPF）级雌性BALB/c小鼠，体质量（20±1.5）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养于独立通风笼盒（individually ventilated cages,IVC）系统内。

病毒：H1N1（A/PR/8/34）流感病毒毒株，由中国农业大学动物医学院国家动物寄生原虫实验室保存，于9日龄SPF级鸡胚尿囊腔传代后，测定对小鼠的半数致死量（median lethal dose,LD50），分装后于-80℃冰箱中储存，备用。

核酶Dz13和对照序列Dz13scr：核酶Dz13的序列（5′-CGGGAGGAAGGCTAGCTACAACGAGA GGCGTTG-Ti-3′）和Dz13scr的序列（5′-GCGACG TGAGGCTAGCTACAACGAGTGGAGGAG-Ti-3′）由华大基因合成。用无菌磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution,PBS）溶解至质量浓度为2 mg/mL，于-20℃冰箱中储存，备用。

试剂：FITC Rat Anti-mouse CD4和PE Antimouse CD8抗体购自美国eBioscience公司；红细胞裂解液购自中科迈晨科技有限公司；TRIzol为美国Invitrogen公司产品；p-c-Jun和c-Jun蛋白抗体为美国CellSignalTechnology（CST）公司产品；FuGENE®6为美国Promega公司产品。其余常规试剂为实验室内储存的药品。

1.2 方法

小鼠攻毒：将小鼠随机分为Dz13+H1N1、DZ13scr+H1N1、PBS+H1N1、PBS 4组，每组 9只。肌内注射Zoletil®（16.5 mg/kg）以麻醉小鼠，随后将3 LD50/只H1N1流感病毒溶于50 μL PBS中，以滴鼻方式给予小鼠。

小鼠给药：以感染病毒时计为0 d，在感染的0和 3 d，将 Dz13 和 Dz13scr（2.5 mg/kg）溶于 50 μL PBS（含2.5 μL FuGENE6和1 mmol/L MgCl2）中，以滴鼻方式给予小鼠。

外周血内CD4+、CD8+T细胞的检测：于感染后3和6 d时，每组小鼠各取3只，摘取眼球采血并处死。收集经抗凝剂处理的外周血200 μL，1 000 r/min离心3 min，弃上清液；加入1 mL红细胞裂解液，轻轻吹打均匀，室温静置10 min，1 000 r/min离心5 min，弃掉上层红色液体；收集沉淀部分，加入1 mL PBS洗涤，1 000 r/min离心5 min，弃上清液；加入0.5 mL PBS重悬，加入FITCAnti-mouse CD4抗体和PE Anti-mouse CD8抗体，混匀，避光静置约20 min；用BDAccuri®C6 Plus流式细胞仪检测。

用蛋白质印迹法（Western-blotting,WB）检测肺内c-Jun蛋白的表达：在取下来的肺组织（大约全肺的1/3）中加入1 mL RIPA蛋白裂解液[含10 mmol/L苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF）]，在低温条件下用玻璃研磨器将组织匀浆。在冰上作用30 min后，以1.2×104r/min离心10 min，取上清液。按比例加入上样缓冲液，煮沸10 min。用二喹啉甲酸（BCA）法测定蛋白质量浓度后，将各组蛋白样品质量浓度调整为2 μg/μL，取18 μL样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE），用湿转法将蛋白胶样品于60 V电压下2 h内转膜至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride,PVDF）上。用5%脱脂奶粉室温封闭l h。一抗用p-c-Jun（1∶1 000）抗体、c-Jun（1∶1 000）抗体和β-tubulin（1∶1 000）抗体孵育过夜（4℃），用0.5%PBST溶液洗膜后，用HRP标记的羊抗兔二抗（1∶2 000）室温孵育1 h。经0.5%PBST溶液洗膜后，用ECL化学发光试剂盒显色并进行结果分析。

用实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）检测肺内细胞因子的表达：取100 μL外周血，用红细胞裂解液裂解后，1 000 r/min离心10 min，收集沉淀细胞。按照TRIzol说明书提取各组细胞总RNA。取2 μg总RNA，按照全式金反转录试剂盒操作说明将RNA反转录为cDNA，以20 μL反应体系进行PCR扩增。每个样本设3个重复。反应程序：95℃预变性90 s；95 ℃退火5 s，58 ℃延伸30 s，共30个循环。获得各样本待测基因的扩增循环阈值（CT）值，采用 2-△△CT

法进行数据处理。引物序列见表1。

表1 细胞因子的引物序列Table1 Primer sequences of the target cytokines

1.3 数据分析

采用Graphpad Prism 6.0软件作图。采用SPSS 17.0软件中的单因素方差分析及Tukey事后检验对试验所得数据进行统计学分析。

2 结果与分析

2.1 Dz13对c-Jun蛋白表达的抑制作用

用蛋白质印迹法检测肺组织内c-Jun蛋白的表达量，结果（图1）表明：小鼠攻毒后，与未感染组（PBS）相比，肺内c-Jun（p-c-Jun）蛋白的活化水平明显上调，随着感染后时间的递增，在6 d时肺内c-Jun蛋白的活化程度明显低于3 d时的水平。Dz13用药组（Dz13+H1N1）c-Jun蛋白（t-c-Jun）的表达受到抑制，在3 d时的抑制水平高于6 d，随着t-c-Jun蛋白表达受到抑制，活化的c-Jun蛋白表达量也随之降低。说明病毒感染后可以引起c-Jun蛋白的活化，核酶Dz13可以特异性地抑制c-Jun蛋白表达及其活化。

图1 Dz13对病毒感染小鼠肺内c-Jun蛋白表达的影响Fig.1 Effect of Dz13 on c-Jun protein expression in lungs of infected mice

2.2 c-Jun蛋白对病毒感染引起的CD4＋和CD8＋T细胞增殖的影响

病毒感染机体后，可以迅速激起机体的免疫反应。使用流式细胞术检测感染后3和6 d小鼠外周血内CD4+和CD8+T细胞的增殖，结果（图2）表明：小鼠感染病毒后，外周血内CD4+和CD8+T细胞的数量与对照组相比明显增多；而核酶Dz13用药组与Dz13scr相比，CD4+和CD8+T细胞的增殖受到抑制（P＜0.05）。说明c-Jun蛋白参与调节流感病毒感染后小鼠体内CD4+和CD8+T细胞的增殖。

图2 Dz13对病毒感染小鼠外周血内CD4＋（A）和CD8＋（B）T细胞增殖的影响Fig.2 Effect of Dz13 on proliferation of CD4＋(A)and CD8＋(B)T cells in peripheral blood of infected mice

2.3 c-Jun蛋白对病毒感染后引起的细胞因子表达的调节作用

流感病毒感染后一个特征性变化就是细胞因子表达量的上调。在本研究中，为测定c-Jun蛋白对病毒感染后细胞因子表达量的调节作用，我们使用qRT-PCR测定感染后3和6 d小鼠外周血内细胞因子的表达情况。从图3中可见：病毒感染后，细胞因子IFN-γ、IL-6和IL-10明显地上调表达；Dz13用药后，Dz13+H1N1组细胞因子IFN-γ、IL-6和IL-10表达量明显低于Dz13scr+H1N1组和PBS+H1N1组（P＜0.05）。说明c-Jun蛋白参与调节流感病毒感染后细胞因子的表达。

图3 Dz13对病毒感染小鼠外周血内细胞因子表达量的影响Fig.3 Effect of Dz13 on cytokine expression in peripheral blood of infected mice

3 讨论

原癌蛋白c-Jun和c-fos以异二聚体的形式组成转录因子AP-1（activator protein-1），AP-1可以调控多种基因的转录，是JNK通路中发挥生物学效应的主要分子，参与细胞增殖、分化、凋亡等的调节过程。大量研究证实：在流感病毒感染的早期可以检测到c-Jun活化蛋白（p-c-Jun），并启动下游IFN-β等一些抗病毒细胞因子的转录；抑制c-Jun蛋白表达后能够导致IFN-β转录水平降低，病毒繁殖率升高[5-6]。同时，有研究发现，JNK-/-小鼠可抑制感染后引起的CD8+T细胞的增殖[7]。而c-Jun蛋白作为JNK通路的效应因子是否参与流感病毒感染后CD4+和CD8+T细胞的增殖还不清楚。在本研究中，阻断小鼠体内c-Jun蛋白的表达后，流感病毒感染后c-Jun蛋白的活化明显降低，外周血内CD4+和CD8+T细胞的增殖均受到抑制。进一步证实了c-Jun蛋白作为JNK通路的效应分子，在流感病毒感染后所引起c-Jun蛋白的活化，参与了T细胞增殖和炎性反应等的调节。

脱氧核酶DRz是人工合成的具有酶活性的DNA分子，能在一定条件下识别并结合靶底物mRNA于配体结合部位形成螺旋，催化切割后与之分离，再结合其他底物，从而持续地抑制底物基因的表达。因其廉价、低毒、高稳定性、高特异性等优点，目前已成为分子生物医药等多个领域的研究热点。c-Jun蛋白在肺癌、肝癌等多种肿瘤中异常表达，在肿瘤的发生发展中发挥着重要作用，因此，c-Jun蛋白在肿瘤及抗感染治疗中可以作为一个有效靶点而存在。Dz13作为脱氧核酶的一种，通过与c-Jun核酸序列的特异识别，发挥基因表达抑制效应和高效的剪切活性。目前已经广泛应用在抗皮肤癌、血管形成、细胞增殖迁移等方面的研究中[8-9]。将Dzl3体外转染至人类微血管内皮细胞中，发现c-Jun蛋白表达减少，裸鼠皮肤鳞状细胞癌、黑色素瘤等皮肤癌细胞的迁移、侵袭受到抑制[10]。在本研究中，Dz13作用于流感病毒感染小鼠后，可以明显抑制流感病毒感染引起的c-Jun蛋白的活化和表达及CD4+和CD8+T细胞的增殖和炎性因子的上调表达。此研究结果提示我们，在流感病毒感染后可以通过使用特异性Dz13阻断c-Jun蛋白表达来抑制感染后的过度炎性反应。结合Dz13的诸多优势，其在抗病毒感染应用中将具有重要的潜能，可以为抗病毒药物的筛选提供参考。