大兴安岭野生盘龙参人工组织培养繁殖

●刘德文 张春英 仲伟利 齐会娟 张 新 湛鑫琳

（黑龙江省大兴安岭地区农林科学院 黑龙江 加格达奇 165000）

盘龙参为兰科盘龙参属植物，学名绶草（Spiranthes sinensis.(Pers.)Ames.Orch.），又名龙抱柱、盘龙草，株高15～20cm，茎基部簇生数条肉质根。在黑龙江省大兴安岭地区呼中、塔河、加格达奇等地区有野生分布。盘龙参根或全草入药，主要含香豆精甙和生物碱，性平，味甘、苦，归肺经、心经，有滋阴益气，凉血解毒，涩精，强壮[1]的功效。由于盘龙参植株天然数量少，目前在上述地区没有发现大面积的盘龙参群落，其种子在自然条件下萌发率低，给人工栽培带来困难，有效成分难以富集，阻碍了药用价值的应用。为了更好地开发利用这一珍贵的寒温带药用资源，本文作者以盘龙参组织培养为目标，目的是研究一种以地下隐芽作为外植体进行人工组织培养繁殖栽培盘龙参的方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以黑龙江省大兴安岭加格达奇区野生盘龙参为试验材料。取盘龙参当年生地下隐芽为外植体。

1.2 试验方法

1.2.1 外植体消毒 取盘龙参隐芽外植体，对其进行消毒处理：用自来水冲洗5～10分钟，用75%的（体积）酒精浸泡1～2分钟，再分别用0.1%（质量）的氯化汞及10%（体积）的次氯酸钠作消毒剂浸泡消毒，最后用无菌水冲洗3～5次。

不同消毒剂及消毒时间对比试验，结果见表1。

1.2.2 诱导培养 外植体消毒后进行初代诱导培养。

初代诱导培养基：改良MS[7]+IAA1.5mg/L+6-BA0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6.8g/L。

将外植体接种于初代诱导培养基中，给予2 000～2 500Lux的光照，每天光照时间为12小时，培养温度 22～24℃，培养 20～25 天[2][3]。

表1 外植体消毒剂、消毒时间对比

图1 盘龙参外植体-地下隐芽接种

图2 外植体-地下隐芽接种15天后膨大

1.2.3 继代增殖培养 将经过初代培养后的外植体转移培养接种于继代增殖培养基上，给予2 500～3 000Lux的光照，每天光照时间为16小时，培养温度24～26℃，以40～50天为1个周期进行继待培养[4][8]。

继代增殖培养基：MS+BAP+GA3+蔗糖30g/L+琼脂粉6.8g/L[5][6]。

继代过程中在培养基中进行了不同激素浓度培养试验，其间（接种到继代增殖培养基20天后）进行红光照射10～15天试验，光强1000～1 500Lux的光照，每天光照时间为16小时，培养温度24～26℃。

不同激素浓度增殖培养基、不同处理丛生芽诱导、增殖对比试验，结果见表2。

表2 不同激素浓度增殖培养基、不同处理丛生芽诱导、增殖结果

图3 外植体-地下隐芽接种25天后

图4 丛生芽增殖

1.2.4 生根培养 继代培养芽不断繁殖后，将丛生芽在无菌条件下分割成单株，每个单株保证带有根原基。将分割后的单株转移至生根培养基中，给予1500～2000Lux的光照，每天光照时间为10小时，培养温度 20～25℃，培养 20～25 天[9]。

生根培养基：1/2MS+IBA+蔗糖20g/L+琼脂粉6.8g/L+活性炭5g/L、1/2MS+NAA+蔗糖20g/L+琼脂粉6.8g/L+活性炭5g/L。

进行不同激素浓度生根培养基生根率对比试验，结果见表3。

表3 不同激素浓度生根培养基生根率

1.2.5 试管苗移栽

将已生根的试管苗在培养的试管中不开口移到自然光照下锻炼5～6天，然后打开棉塞开口炼苗1～2天，再移栽到移栽基质中，移栽基质为1：1的腐殖质和苔藓混合物。移栽后5～7天内保证 85%～90%的空气湿度，幼苗管理的生长温度是20～24℃。直到幼苗缓苗成活，完成了盘龙参组织培养繁殖全过程。

2 结果与分析

2.1 不同消毒剂及消毒时间处理外植体消毒对比试验结果

10%（体积）的次氯酸钠作消毒剂消毒效果不好，不能作为盘龙参组织培养外植体消毒剂。

用自来水冲洗5～10分钟，用75%（体积）的酒精浸泡1分钟，再用0.1%（质量）的氯化汞浸泡4分钟，无菌水冲洗3～5次，外植体消毒效果最好。污染率最低，成活率最高。

2.2 继代增殖培养试验结果

通过对不同激素浓度增殖培养基、不同处理丛生芽诱导增殖对比试验，得出：增殖培养基MS+BAP2.0mg/L+GA30.5mg/L+蔗糖 30g/L+琼脂粉6.8g/L表现最好，同时在继代增殖培养过程中（接种到继代增殖培养基20天后）进行红光照射10～15天，光强1000～1500Lux的光照，每天光照时间为16小时，培养温度24～26℃。可提高增殖倍数，丛生芽增殖了10倍。

2.3 生根培养试验结果

生根培养基：MS+IBA0.5mg/L+蔗糖20g/L+琼脂粉6.8g/L+活性炭5 g/L，1 500Lux光照，每天光照时间为10小时，培养温度20℃，培养20天后丛生芽生根率可达80%。

3 结论

以盘龙参当年生地下隐芽为外植体，用自来水冲洗5分钟，用75%（体积）的酒精浸泡1分钟，再用0.1%（质量）的氯化汞浸泡4分钟，无菌水冲洗3～5次，外植体灭菌效果最好，成活率高。

初代诱导培养基：改良MS+IAA1.5mg/L+6-BA0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6.8g/L。2 000Lux的光照，每天光照时间为 12小时，培养温度22～24℃，培养 20～25 天。

继代增殖培养基MS+BAP2.0mg/L+GA30.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6.8g/L，2500Lux的光照，每天光照时间为16小时，培养温度25℃，以40～50天为1个周期进行继待培养。其间（接种到继代增殖培养基20天后）进行红光照射10～15天，光强1000～1500Lux的光照，每天光照时间为16小时，培养温度24～26℃。

试管苗生根培养基：MS+IBA0.5mg/L+蔗糖20g/L+琼脂粉6.8g/L+活性炭5g/L，生根率高。

试管苗移栽基质1：1的腐殖质和苔藓混合物。

通过上述试验方法，经过初代、继代增殖、生根培养、移栽，可实现盘龙参地下芽隐组织培养繁殖。本方法简捷，经济实用，可操作性强，达到了快繁的目的，可用于兰科植物盘龙参的工厂化育苗。盘龙参人工组织培养技术的研究成功，可为黑龙江省大兴安岭地区野生资源的开发利用提供技术保障。