抗核抗体荧光核型联合抗核抗体谱检测结果分析

李 晗，赵 枰，陈 相

（南通市第一人民医院检验科，江苏226001）

自身免疫性疾病（autoimmune diseases,AID）发病原因多样,可能与微生物感染、细胞基因突变有关,亦可能原因不明,但最终都引起机体细胞免疫异常和免疫调节功能紊乱。免疫系统对自身组织、器官和细胞产生异常免疫应答反应[1-3],导致组织器官功能障碍。目前诊断自身免疫性疾病仍是在结合临床表现的基础上,依赖实验室检查。在患者外周血中检测抗核抗体（antinuclear antibody,ANA）、ANA荧光核型和抗核抗体谱（antinuclear antibodies,ANAs）是较为常用而重要的自身免疫性疾病的诊断方法[4-5]。本研究回顾性分析本院2017年11月—2018年4月住院的申请抗核抗体谱检测的标本982例,比较间接免疫荧光法（indirect immunofluorescenc,IIF）筛查ANA荧光核型与线性免疫印迹分析法（line immunoassay,LIA）检测ANAs特异性抗体的结果,分析二者检测间的相互关系及临床意义,为临床AID的诊断提供可靠依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 982例标本同时采用IIF法检测ANA和LIA检测ANAs 15项,其中确诊AID 65例,非AID患者917例,包括疑似AID 99例,其他疾病712例,无明确诊者104例。AID诊断符合国际相关学会的诊疗指南。送检标本均为清晨空腹静脉血。

1.2 IIF法检测ANA荧光核型 采用德国欧蒙医学实验室诊断股份公司HEP-2和灵长类肝组织冰冻切片的组合IIF法检测血清ANA。德国欧蒙PML型荧光显微镜判读结果,以抗体滴度≥荧光100为阳性。将1∶100 PBS吐温缓冲液稀释的血清标本与抗原基质片在载片反应区反应,温育30 min,流水冲洗2 s,浸泡5 min,加入荧光标记的二抗,避光孵育30 min,流水冲洗2 s,浸泡5 min,加甘油封片后荧光显微镜下判读结果。严格按照试剂操作说明书操作。

1.3 LIA法检测ANAs 采用德国欧蒙（杭州）医学诊断有限公司检测试剂,含有15个测定项目：抗nRNP/Sm、抗 Sm、抗 SSA、抗 R052、抗 SSB、抗 SCL-70、抗 PM-Scl、抗 J0-1、抗 CENP B、抗核小体抗体、抗PCNA、抗ds-DNA、抗组蛋白抗体、抗核糖体P蛋白抗体、抗AMA-M2。采用配套软件EURO LineScan进行显色结果灰度值扫描分析,灰度值0～5为阴性（-）,6～10 为临界（±）,≥11为阳性（+）。膜条上平行包被经亲和层析纯化的天然抗原,其中CENP B、PM-Scl、Ro-52、PCNA 为重组抗原。1∶101 稀释的血清标本1.5 mL与膜条上靶抗原反应30 min,洗涤3次,5 min/次,加入1.5 mL酶标记抗人IgG（酶结合物）温育30 min,洗涤3次,5 min/次,加入底物液反应15 min,蒸馏水清洗膜条终止反应,风干后扫描。

1.4 统计学处理 应用SPSS13.0统计学软件进行数据分析,计数资料以率表示,差异性比较采用χ2检验,以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 IIF和LIA检测 982例标本中,至少一种方法阳性218例,阳性率22.20%,单独IIF检测阳性207例,阳性率21.08%,单独LIA检测阳性147例,阳性率 14.97%,IIF 检测阳性率高于 LIA（P＜0.01）,差异有统计学意义。

2.2 IIF阳性标本各种核型的阳性率 IIF检测ANA阳性标本207例中以抗体高滴度为主,各核型阳性率依次为均质型72例（34.78%）,颗粒型70例（33.8%）,胞质颗粒型37例（17.87%）,核仁型16例（7.73%）,着丝点型11例（5.31%）,胞浆纤维型1例（0.48%）,表明ANA核型以均质型与颗粒型为主,提示自身免疫性疾病以 SLE、RA、MCTD、PSS、PM/DM 为主。

2.3 LIA阳性标本各特异性抗体的阳性率 LIA法检测ANAs阳性标本147例中抗nRNP/Sm 22例（14.97%）,抗 Sm 4例（2.72%）,抗 SSA 48例（32.65%）,抗SSB 8例（5.44%）,抗Ro-52 49例（33.33%）,抗SCL-70 1例（0.68%）,抗Jo-1 1例（0.68%）,抗 PM-Scl 0例,抗 CENP B 11例（7.48%）,抗PCNA 1例（0.68%）,抗dsDNA 4例（2.72%）,抗核小体3例（2.04%）,抗组蛋白2例（1.36%）,抗核糖体P蛋白8例（5.44%）,抗AMAA2 10例（6.80%）。如ANAs中单个抗体阳性时应结合临床及随访,以防自身免疫性疾病的漏诊。

2.4 自身免疫疾病组和非自身免疫疾病组ANA及ANAs阳性率比较 ANA在自身免疫性疾病组的阳性率（96.92%）显著高于非自身免疫性疾病组（13.09%）,ANAs在自身免疫性疾病组的阳性率（73.85%）也显著高于非自身免疫性疾病组（7.96%）,在自身免疫性疾病组中ANA与ANAs检测阳性率比较,差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 自身免疫疾病组和非自身免疫疾病组ANA及ANAs阳性率比较 n（%）

3 讨 论

自身免疫性疾病病程中存在特征性的自身抗体谱,是诊断自身免疫性疾病的重要依据,也是观察病情和判断疗效的主要指标。近年来IIF法是国内ANA常规初筛方法：基质（Hep-2细胞和猴肝片）容易制备,含有的抗原谱较完整,敏感度高,特异性强,并可产生可判读的特征性荧光[6]。但该法以手工操作为主,难以标准化,读片有一定主观性,结果准确性很大程度上取决于检验师的经验[7]。ANAs检测逐渐完善并广泛开展,对特异性抗体检测有助于明确诊断。ANA-LIA操作简便,一次可检测多种特异性自身抗体,且有较高的敏感性和特异性,因此,作为ANA检测“金标准”的IIF法受到严峻的挑战[8-10]。

本研究对IIF法检测ANA与LIA法检测ANAs的结果进行比较,发现单独IIF检测的阳性率高于单独LIA检测,可能的原因是IIF抗原基质包含的抗原种类比LIA检测ANAs的抗原种类多,且IIF法中载玻片上覆盖的基质抗原分布均匀。但IIF抗原基质中抗原含量远低于LIA法,因而IIF法检测导致几乎所有种类ANAs特异性抗体的漏检。其次,虽然可通过对IIF检测的ANA荧光模型进行分析,初步判断相应抗体的性质,但同种抗体可出现不同的荧光模型,不同抗体亦也可出现相同的荧光模型,因此荧光模型只具有一定的提示作用,不能准确反映靶抗原。本研究结果显示,自身免疫性疾病组ANA阳性检出率、ANAs阳性检出率明显高于非自身免疫性疾病组,差异均有统计学意义（P＜0.05）。在自身免疫性疾病患者中,两种方法检出率的差异也有统计学意义（P＜0.05）,与文献报道的结果相符[11]。ANA阳性、ANAs阴性的可能原因：（1）所用的ANA-LIA法膜条只能检测15种特异性自身抗体,ANA-IIF阴性不排除有其他特异性抗体的存在；（2）膜条上可溶性抗原包被不牢固,操作过程中可被洗去而出现LIA假阴性等[12-13]。ANA阴性、ANAs阳性的可能原因：（1）血清中其他抗体效价较强,在IIF检测中自身抗体被遮蔽,而在LIA法单条带分析中被捕获显现；（2）基质（Hep-2细胞和猴肝片）细胞不是某些抗体的最佳检测基质细胞,如Jo-1抗体,且基质细胞抗原成分可能不均匀分布、含量低,以及不同固定方法可能对特定抗原的抗原性的破坏等因素[14-15]。

综上所述,临床上对自身免疫性疾病进行筛查时,单独采用IIF检测ANA,可能因为方法学的差异而漏检ANA谱阳性样本；而LIA检测ANAs因自身抗体数量有限,亦容易导致自身免疫性疾病漏诊。因此,临床上筛查自身免疫性疾病应进行IIF-ANA和LIF-ANAs的联合检测,避免仅采用一种方法检测导致的漏诊,为自身免疫疾病的准确诊断和及时治疗提供有力的帮助。